大鲵低聚糖肽性质初步研究

大鲵低聚糖肽 2010 年 11 月由辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室制备; 咔唑、无水乙醇、四硼酸钠、间羟基联苯、乙酰丙酮、对－二甲基苯甲醛、无醛乙醇、间苯二酚、硫酸铜、乙酸丁酯－丁醇( 体积比 4∶1) 、盐酸、浓硫酸等试剂 均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 大鲵低聚糖肽基本组成测定 准确称取 0.5g大鲵低聚糖肽，于 100mL 容量瓶中定容，制得大鲵低聚糖肽溶液，备用。

1.2.1.1 蛋白含量测定 采用 Follin－酚法。取大鲵低聚糖肽溶液 20μL，置于干净的试管内，加 5mLFollin 甲液，置于 25℃ 水浴中 10min 后，加入 0.5mLFollin 试剂乙，继续水浴 30min，于 500nm 处测量吸光值。

1.2.1.2 糖含量测定 采用苯酚－硫酸法。取 0.1mL大鲵低聚糖肽溶液，加入 1mL 6% 苯酚溶液后，加 5mLH2 SO4，静置 20min，于 490nm 处测量吸光值。

1.2.1.3 盐酸氨基葡萄糖含量测定 采用乙酰丙酮法。取大鲵低聚糖肽溶液 0.5mL，置于干燥的具塞比色管中，加水至 5.0mL，然后加 1.0mL 乙酰丙酮溶液，摇 匀，于沸水浴中加热 25min，取 出，冷 却。加对－二甲基苯甲醛溶液 1.0mL，摇匀，60℃ 水浴 1h，放置冷却，于 525nm 处测量吸光值。

1.2.1.4 半乳糖醛酸含量测定 采用硫酸咔唑法。取大鲵低聚糖肽溶液 1.0mL，置于干燥的具塞比色管中，冰水浴中加入四硼酸钠－ 硫酸溶液 5.0mL，混匀后，沸水浴加热 20min，取出后立即冷却至室温，加0.15% 咔唑溶液 0.2mL，摇匀，在室温下保持 2h，在530nm 处测量吸光值。

1.2.1.5 葡萄糖醛酸含量 采用间羟联苯法。取大鲵低聚糖肽溶液 0.5mL，加入试管中，置冰水浴中，加入 4.5mL 四硼酸钠－硫酸溶液，继续冷却，充分振荡，将试管置于沸水浴中加热 10min，立即放入冰水浴中冷却，加入 0.05mL 0.15% 间羟基联苯溶液，充分振荡，静置 20min，在 525nm 处测量吸光值。

1.2.1.6 唾液酸含量测定 采用间苯二酚法。取大鲵低聚糖肽溶液 1.0mL，置于干净的试管内，加间苯二酚 － 盐 酸 溶 液 ( 分 别 量 取 2% 间 苯 二 酚 溶 液2.5mL，0.1mol /L 硫酸铜溶液 62.5μL，25% 盐酸溶液20mL，加水稀释至 25mL，混匀。实验前 4h 内配制)1mL，沸水浴 30min，取出置冰浴 3min，加乙酸丁酯－丁醇液( 乙酸丁酯－丁醇的体积比 4∶1) 2mL，充分混匀，室温放置 10min，在 580nm 处测量吸光值。

1.2.2 大鲵低聚糖肽氨基酸组成分析 将大鲵低聚糖肽干燥至恒重，取一定量样品在 6mol /L 盐酸中，在 110℃条件下消化 24h，脱酸后，用水定容至 5mL，在氨基酸自动分析仪上测定样品中氨基酸的组成。

1.2.3 β－消旋反应测定糖肽键连接方式 准确称取大鲵低聚糖肽样品 5mg，溶于 3mL 蒸馏水中，然后将样品 溶 液 分 成 两 等 份，各 1.5mL。其 中 一 份 加 入1.5mL 蒸馏水; 另一份加入 1.5mL 0.4mol /L NaOH 溶液，反应2h 后，两份溶液分别在200～400nm 范围内进行紫外光谱扫描，得到 β－消除反应前后紫外扫描图。

1.2.4 血细胞凝集法测定糖肽键连接方式 采用专一性识别－Galβ1－3 GalNAc α－O－Ser/Thr 结构的凝集素( CAL，海绵凝集素) ，进行三组 B 型血红细胞凝集实验。第一组在血红细胞悬液中加入凝集素; 第二组血红细胞悬液; 第三组在血红细胞悬液中加入凝集素和大鲵低聚糖肽。室温孵育 30min 后显微镜下观察血红细胞凝集现象。1.2.5 红外光谱测定 取一定量的大鲵低聚糖肽干粉与 KBr 混合压片，在 400～4000cm－ 1范围内进行红外光谱扫描。

 

2.1 大鲵低聚糖肽基本组成分析

经化学分析方法测定大鲵低聚糖肽的基本组分，结 果 见 表 1。大鲵低聚糖肽中总糖含 量 为15.15% ，总蛋白含量为 80.01% 。其中盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和唾液酸含量分别3.39% 、0.65% 、2.45% 和 0.60% 。葡萄糖醛酸具有抗肿瘤、抗凝血、增强机体免疫力的作用，是刺参酸性粘多糖的主要成分。唾液酸具有提高人体免疫力、抗痴呆、提高记忆力和智力的作用，是燕窝的主要功能成分。因此，组成大鲵低聚糖肽的糖成分对人体具有保健功能。

大鲵低聚糖肽的氨基酸组成见表 2。由表 2 可知，大鲵低聚糖肽中所含的 18 种氨基酸中除色氨酸未测出外，人体其它 7 种必需氨基酸( 苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸)和组氨酸( 婴儿所必需的氨基酸) 的含量均较高。其中必需氨基酸中苏氨酸含量最为丰富，高达 13.1% 。其次是天冬氨酸/酰胺( Asx) 和谷氨酸/酰胺( Glx) 分别为 11.2% 和 12.5% 。而丝氨酸含量最低为 0.2% 。精氨酸为人体半必需氨基酸，有良好的降血压作用。苯丙氨酸是人体内肾上腺素、甲状腺和黑色素合成的原料。组氨酸对婴幼儿也属于必需氨基酸，在新生儿及儿童生长发育期起着非常重要的作用。它具有抗溃疡和促进细胞再生的作用，幼儿缺乏组氨酸将导致贫血。由此可见，大鲵低聚糖肽具有潜在的多种保健功能。

2.2 大鲵低聚糖肽键特征分析β－消旋反应是一种鉴定糖肽键中是否存在 O－连接糖肽键的常用方法，O－连接糖肽键在碱作用下很容易断裂。糖肽键在用碱处理时，与 O－糖肽键连接的丝氨酸生成 α－氨基丙烯酸，苏氨酸生成 α－氨基丁烯酸，这种不饱和氨基酸的形成，在 240nm 波长处紫外吸收增强。其 β－消旋反应前后大鲵低聚糖肽的紫外吸收图谱如图 1。由图 1 可见，在 240nm处 β－消旋反应后大鲵低聚糖肽的紫外吸收显著增强，说明大鲵低聚糖肽中存在 O－连接糖肽键。