专业论文 您现在的位置：首页 > 科研成果 > 专业论文
大鲵黏液酶解产物的制备及其抗疲劳作用研究
摘 要: 以大鲵黏液为原料，采用复合蛋白酶进行酶解，研究其最佳酶解条件以及酶解产物抗疲劳作用。结果表明，酶解 大鲵黏液的最佳工艺条件为复合酶加量为0.5% ( 质量比) 及底物浓度为0.1mg /mL 时，酶解时间2h，pH8.0，温度65℃。时 间飞行质谱表明酶解产物为分子量小于 4000，苯酚硫酸法测定其为低聚糖肽。将低聚糖肽给小鼠灌胃 15d 后进行小鼠 负重游泳实验，结果显示大鲵低聚糖肽组使小鼠游泳力竭时间达到 103min( P < 0.01) ，肝糖原的消耗量比空白对照组减 少 65.0% ，肌肉中乳酸的量比空白对照组减少了 24.4% 。结果表明，大鲵低聚糖肽具有显著抗疲劳作用。
关键词: 大鲵黏液，复合蛋白酶，抗疲劳，小鼠
大鲵( Andrias davidianus) 属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，是我国特有的珍稀特产，属国家二类保护动物。主要分布于长江中上游、珠江中上游及汉水上游的溪流中。上世纪 90 年代以来，湖南、湖北、陕西及广西都建立了大量的大鲵驯养繁殖企业。仅湖南省就有大鲵驯养繁殖企业 35 家左右，年繁殖能力已达 4～5 万尾。随着养殖规模的发展，大鲵资源的精深加工利用成为一个关系大鲵产业持续发展的紧迫课题。目前，对大鲵的深加工均是宰杀后提取皮、肉、骨来利用，这样的利用方法对大鲵资源的保护与繁殖非常不利。另一方面，大鲵体表无鳞，多皮肤腺，在生长过程中不断分泌黏液。如果能够对大鲵体表黏液进行利用，就可以做到既利用大鲵资源，又不危害大鲵的生长繁殖，实现大鲵资源可持续利用的最理想状态。本文以大鲵黏液为原料，采用复合酶进行酶解，制备出分子量小于 4000 的大鲵低聚糖肽。利用小鼠进行抗疲劳实验，发现大鲵低聚糖肽具有抗疲劳作用，是保健食品潜在的原料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大鲵黏液 2009 年 9 月由张家界( 中国) 金驰大鲵生物科技有限公司制备; 海洋碱性蛋白酶 由俄罗斯科学院远东分院太平洋生物有机化学研究所提供; 胰蛋白酶( 1∶250) 购于北京索莱宝( Solarbio) 科技有限公司; 其他化学试剂 均为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵黏液酶解液的制备 取新鲜大鲵黏液，洗净后用组织捣碎机研磨成糜，经硫酸铵沉淀法得大鲵黏液蛋白粗提液。将海洋碱性蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为7∶3 比例混合作为酶解用复合酶，改变温度、pH、加酶量和时间等因素，测定肽含量。
1.2.2 蛋白含量和酶解液肽含量的测定 蛋白含量采用 Folin－酚法测定。采用三氯乙酸( TCA) 沉淀大分子蛋白质后，采用 Folin－ 酚法测定酶解液的肽含量。
1.2.3 糖含量的测定 采用三氯乙酸( TCA) 沉淀大分子蛋白质后的酶解液用苯酚－硫酸法检测样品中糖含量。
1.2.4 酶解产物分子量分布的测定 冻干的酶解产物用 5～10μL 0.15% 三氟乙酸( TFA) 溶解。然后离心取上清液与等体积的基质混合点靶进行时间飞行质谱( MALDI－TOF) 测定。质谱仪为 Bruker Autoflex时间飞行质谱( Bremen，德国) 。质谱测定条件: N2 激光源，波长 337nm，正离子线性方式检测( 飞行管长1.6m，加速电压 25kV) 。基质: 芥子酸( SA) ，用 0.1%TFA/50% 乙腈配成饱和溶液，再将该溶液与 0.1%TFA/50% 乙腈以 1∶1 的比例混合。
1.2.5 小鼠负重游泳实验 按谢伟斌等的方法。
选昆明种雄性小鼠 16 只，3～4 周龄，体重( 16 ± 2) g，随机分成实验组和对照组，每组 8 只。每天灌胃 1次，连续 15d，实验组灌胃剂量为 1.6mg /kg 体重，每个剂量组每天灌胃剂量 0.1mL /16g 体重，对照组灌服相同体积生理盐水。在末次灌胃 30min 后，给小鼠尾部负重 5% 的铅丝，在恒温水槽中进行游泳，水槽深度为 40cm 左右，水温在( 30 ± 2) ℃。小鼠游泳力竭后取出测定生化指标，记录从小鼠开始进入水中至头部全部没入水中 10s 不浮出水面的时间，即为游泳时间。
1.2.6 小鼠肝糖元的测定 取出小鼠肝脏，用生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干后准确称量 0.1g 肝脏，加入 2mL TCA 匀浆，将匀浆在 5000r/min 条件下离心20min，取1mL 上清液，再加入4mL 蒽酮试剂，沸水浴中煮沸 10min，取出后用水冷却，于 620nm 测吸光度。在葡萄糖标准曲线上查出样品液的糖含量。以 1mL蒸馏水为对照。
1.2.7 小鼠肌乳酸的测定 取出小鼠后腿肌肉 0.1g，用生理盐水匀浆，将匀浆 5000r/min 离心 20min，取1mL 上清液，加入蒸馏水至 5mL，加入 20% 硫酸铜1mL，加入氢氧化钙粉末约 0.5g，振摇 1min，静置10min，以 3000r/min 离心 10min，取上清 0.5mL，加入浓硫酸 3mL，充分混匀后，置于沸水浴中 5min，然后放入冷水中 3min。加入 0.5% 对羟联苯溶液 0.15mL，充分混匀后，置于沸水浴中 5min，然后放入冷水中冷却后，于 510nm 测定吸光度。在乳酸标准曲线上查出样品液的乳酸含量。
2 结果与讨论
2.1 复合酶酶解大鲵黏液制备低聚糖肽单因素条件的影响
2.1.1 酶解温度对复合酶酶解大鲵黏液制备低聚糖肽的影响 复合酶酶解大鲵黏液制备的低聚糖肽经苯酚－硫酸法检测糖含量占 27.6% ( 质量比) 。将酶解条件设定为: pH7.5，复合酶量为 0.5% ( 质量比) ，于 35、45、55、65、75℃ 下分别酶解 2h，底物浓度为0.1mg /mL。测定肽含量得结果如图 1 所示。由图 1可知，当酶解温度在 35～65℃ 之间变化时，随着酶解温度继续上升，所得到的肽量逐渐升高，但当温度达到 65℃，肽含量达最大值后，再继续提高酶解温度，所得到的肽含量则出现下降的趋势。温度过高，可以使酶变性甚至失活。所以，最适大鲵黏液酶解反应的温度为 65℃。
2.1.2 pH 对复合酶酶解大鲵黏液制备低聚糖肽的影响 将酶解条件设定为: 复合酶量为 0.5% ( 质量比) ，pH 分别为 5、6、7、8、9，于 65℃ 酶解 2h，底物浓度为 0.1mg /mL。测定所得肽量得结果如图 2。由图2可知，随着 pH 的逐渐升高，肽含量也随着上升，当 pH上升到8.0 时肽含量最大，之后再升高 pH，所得到的肽含量出现下降趋势。原因是复合酶中的海洋碱性蛋白酶与胰蛋白酶本身的最适 pH 在 8.0 左右，pH 过高或过低时会影响海洋碱性蛋白酶与胰蛋白酶的活性。所以，最适大鲵黏液酶解反应的 pH 为 8.0。
2.1.3 酶解时间对复合酶酶解大鲵黏液制备低聚糖肽的影响 将酶解条件设定为: 复合酶量为 0.5%( 质量比) ，pH 为 8.0，底物浓度为 0.1mg /mL，于 65℃酶解时间分别为 1、1.5、2、2.5h，测定所得肽含量结果如图 3 所示。所得肽含量随着酶解时间的增加而增加，酶解时间 2h 以后所得肽量上升幅度平缓。综合生产成本因素，确定酶解时间为 2h 为最佳。
2.1.4 复合酶加量对复合酶酶解大鲵黏液制备低聚的影响 将酶解条件设定为: pH 为 8.0，底物浓度为 0.1mg /mL，于 65℃ 酶解 2h，复合酶加量分别为0.3% 、0.4% 、0.5% 、0.6% 、0.7% ( 质量比) ，测定所得肽量结果如图 4 所示。由图 4 可知，随着酶加量的增加，所得肽含量逐渐升高，复合酶加量大于0.5% 时肽得率上升幅度平缓。综合生产成本和所得肽含量两方面考虑，确定复合酶加量大于 0.5%( 质量比) 。
2.1.5 复合酶最佳酶解条件的确定 影响酶解反应的几个主要因素为复合酶加量、酶解时间、pH 和温度。根据上述单因素实验分析，并考虑生产成本的因素，以所得肽含量为指标做复合酶加量为 0.5%( 质量比) 时，酶解时间、pH 和温度 3 因素 3 水平的正交实验 L9 ( 33) ，正交实验的因素水平见表 1，正交实验结果见表 2。
由表 2 可知，各因素对复合酶酶解大鲵黏液制备低聚糖肽的影响的大小顺序为 C > A > B，即 pH >酶解时间 > 温度，最优水平为 A3B3C2，即 pH 为 8.0，酶解时间 2h，温度 65℃。因此，确定复合酶最佳酶解条件为复合酶加量为 0.5% ( 质量比) 时，时间 2h，pH8.0，温度 65℃，底物浓度为 0.1mg /mL。
2.2 大鲵低聚糖肽时间飞行质谱
图 5 的时间飞行质谱表明复合酶酶解大鲵黏液获得的大鲵低聚糖肽的 m/z 在小于 4000 的区域。m/z主要有 1172.3、1378.4、1436.3、1551.2、1694.9、1866.3、1981.0、2081.3、2200.7、2534.2、2929.2、3133.0、3326.0、3553.5、3907.2。根据含糖量及氨基酸残基分子量可知，获得的糖肽含有氨基酸残基数大约为7～24 个。
2.3 大鲵黏液酶解产物对小鼠游泳时间、各项生化指标的影响灌服大鲵黏液酶解产物对小鼠游泳时间及肝糖元、肌乳酸的影响见表 3。可以看出，灌服大鲵黏液酶解产物的小鼠游泳时间达到 103min，极显著高于对照组 53.7min( P < 0.01) 。小鼠游泳时间的延长，表明大鲵黏液酶解产物－低聚糖肽能延缓运动性疲劳出现的时间，具有抗运动性疲劳的作用。在小鼠负重游泳力竭后，肝糖原的消耗量比空白对照组减少65.0% ，肌肉中乳酸的量比空白对照组减少了24.4% 。肝糖原与肌乳酸是评价机体疲劳的重要指标。肝糖原贮存越多，抗疲劳能力越强，而乳酸堆积越多，疲劳程度越重。表 3 的大鲵低聚糖肽组和对照组中肝糖原与肌乳酸数值也反映了灌服大鲵黏液酶解产物的小鼠具有抗疲劳能力显著提高。
葡聚糖 G－200 柱层析两个洗脱峰的分离组分经凝血活性检测，第一个峰组分具有血液凝集活性，第二个峰组分也具有血液凝集活性，这说明库拉索芦荟凝集素经过分离纯化之后，得到了两种具有凝集活性的蛋白质组分，但至于这两种组分的具体成分还有待进一步的分析研究。
3 讨论
凝集素作为一种非酶和非免疫起源的蛋白质或糖蛋白，广泛存在于动物、植物和微生物中。在不同的植物中其凝集素的成分是不同的，而且不同种子提取物的凝血活性也会因不同动物血细胞而不同，并且对人类各种血细胞具有独立特异性。20世 纪 40 年 代，Boyd 和 Renkonen 发 现 利 马 豆Phaseoluslimensis 和野豌豆 Viciacracca 的粗提物可以凝集 A 型血却不能凝集 B 型和 O 型血，但是芦笋豆Lotustetragonolobus 却能凝集 O 型血。这些豆类凝集素或者是凝集 A 型血细胞，或者是凝集 O 型血细胞，或者是同时凝集 A、B 型血细胞。而芦荟凝集素是一种蛋白质，是一类能够非共价地和糖类结合的蛋白质，它具有高度的糖结合专一性，是生物化学和免疫学研究中的一种广泛应用的工具。芦荟凝集素能专一性地凝集兔血细胞和人血红细胞的 A 型和 O 型，不凝集 B 型和 AB 型。所以可以根据芦荟凝集素特有的凝血性质对其进行鉴定，判断所提取的物质中是否含有芦荟凝集素。而且它能附在人体细胞上，激活人体细胞中天然的生长因子，刺激细胞内部反应，促进细胞生长和分裂，加快受伤组织康复和愈合，增强淋巴细胞功能，从而提高人体抵抗各种疾病的能力和抗感染能力。
在本实验中库拉索芦荟经捣碎匀浆、盐析、透析后得到了芦荟凝集素的粗提液，经凝血活性检测粗提液可以凝集兔血，所以证明了在粗提液中具有芦荟凝集素成分，这也就为下一步实验的可实施性奠定了基础。再将粗提液进行过膜浓缩、葡聚糖 G－75凝胶过滤层析后，分离出三种蛋白质峰，经过凝血活性检测，只有第一个蛋白峰具有凝集活性，且分离纯化后的芦荟凝集素的活性比分离纯化前粗提液中的活性进一步提高了。收集具有活性的收集液，经过浓缩，再用葡聚糖 G－200 凝胶过滤层析后得到了芦荟凝集素的两种组分，经凝血活性检测，两种组分均具有凝血活性，但至于两种组分的具体化学成分是什么还有待于今后进一步的实验研究。
