摘 要：研究大鲵低聚糖肽（GSGPs）对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用。经腹腔注射CCl4制备小鼠急性肝损伤模型，分别灌胃三种不同浓度的GSGPs，以联苯双酯（200mg（/ kg·d））作为阳性对照。检测血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转 氨酶（ALT）活性，肝组织中丙二醛（MDA）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性，观察小鼠肝组织形态学变化。结果表明：GSGPs中（400mg（/ kg·d））、高（800mg（/ kg·d））剂量组可显著抑制小鼠肝脏组织中由CCl4造成的血清中AST、ALT活性的升高，明显降低肝组织MDA含量，并且提高肝组织中SOD活性。光镜检查结果表明，CCl4模型组肝细胞明显肿胀变 形，肝细胞索紊乱，伴有炎症细胞侵润。GSGPs各剂量组的肝细胞索排列整齐、肝细胞排列规则，较模型组肝组织损伤明显减轻。说明GSGPs具有保护CCl4急性肝损伤的作用。
糖链是重要的信息分子，承载着很多重要的生物信息。糖链与蛋白质的相互作用使细胞具有专一识别性，并且能调控各种生命过程如：受精发生、生长、发育、分化、神经系统、免疫系统恒态的维持等，在炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等过程中起重要作用。糖肽是糖修饰的蛋白片断，具有很多生物活性和疾病密切相关。大鲵（Andrias davidianus），俗称娃娃鱼，属有尾目、隐鳃鲵科，是体形最大的两栖动物，也是我国特有的珍稀大型两栖动物，属国家二类保护动物。1999年，大鲵被农业部列为重点开发的养殖品种。目前，全国大鲵人工繁殖单位有100余个，年人工繁殖大鲵幼苗10余万尾，且每年在快速递增，2009年大鲵养殖量接近200万尾。对大鲵深加工产品的研究，均是宰杀大鲵后提取皮、肉、骨来利用，这样对大鲵资源的保护非常不利。另一方面，大鲵体表多皮肤腺，在生长过程中不断分泌黏液，如果能够对大鲵体表黏液进行开发利用，可以起到既利用大鲵资源，又不危害大鲵的生长繁殖的作用，是实现大鲵资源可持续利用的最理想状态。大鲵黏液经酶解制备的大鲵低聚糖肽（GSGPs）存在O-连接糖苷键，具有抗氧化、提高免疫、抗疲劳、抗紫外等生物学活性，本文研究了大鲵GSGPs对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用，以期为大鲵黏液的利用以及大鲵产业化提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
GSGPs 辽宁省水产品加工及综合利用重点实 验室制备；清洁级昆明种小鼠（体质量18~22g，雌雄 各半） 大连医科大学实验动物研究中心[SCXK（辽） 2008-0002]；联苯双酯（DDB，批号100505） 浙江医 药有限制造公司；谷丙氨酸转移酶（ALT/GPT）测定 试剂盒（批号20110608）、谷草氨酸转移酶（AST/GOT） 测定试剂盒（批号20110613）、丙二醛（MDA）测定试 剂盒（批号20110613）、超氧化物岐化酶（SOD）测定 试剂盒（批号20110613）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂 盒（批号20110607） 南京建成生物工程公司。 荧光显微镜 雷勃公司；BS110S型分析天平 北 京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-754型紫外可见分 光光度计 上海第三分析仪器厂；IEC型微量台式小 型离心机 德国制造；GL-21M型高速冷冻离心机 长 沙湘仪离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 肝损伤小鼠及给药 选昆明种小鼠48只，随机分成对照对照组、模型对照组和联苯双酯阳性对照组 [200mg/（kg·d）]，GSGP浓度按照羊栖菜水溶性多糖保 肝活性研究中的剂量，分为低浓度[200mg/（kg·d）]、 中浓度[400mg/（kg·d）]、高浓度[800mg/（kg·d）]剂量 组，每组8只，于12h黑暗、12h光亮的塑料饲养箱内饲 养，室温（20±2）℃，湿度40%~60%，自由采食和饮水。 各给药组每天灌胃1次，连续7d。对照组和模型组给 予同样量的生理盐水，于末次给药2h后，对照对照组 按10μL/g的标准腹腔注射植物油，其余每组均按 10μL/mg标准腹腔注射0.2% CCl4植物油溶液。禁食 20h后，断头取血，在30min内，3500r/min，离心5min后 得上层血清备用。 快速处死小鼠取肝脏，并在肝左叶组织取约0.3g 放冰冷的生理盐水中漂洗，取出后用滤纸将水吸干， 制成10%肝组织匀浆液（生理盐水的体积总量是组 织块体积的9倍），制备好的10%的肝组织匀浆液在 低温低速离心机中以2000r/min左右离心10~15min， 将离心好的匀浆保留上清液弃沉淀待测。
1.2.2 生化指标检测与病理学观察 血清中谷草转 氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）活性，肝脏组织中丙 二醛（MDA）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性以及 肝组织中蛋白含量均按试剂盒的要求进行测定。处 死小鼠后，取肝脏右叶组织约0.3g，用10%的中性甲 醛溶液进行固定，石蜡包埋切片。苏木精-伊红（HE） 染色，在显微镜下进行病理学观察。
1.2.3 统计学处理 用SPSS统计软件对实验数据进 行处理，数值以x±s表示。
2 结果与讨论
2.1 GSGPs对CCl4致肝损伤小鼠的生化指标影响 GSGPs对CCl4致肝损伤小鼠生化指标影响的实 验结果如表1所示，腹腔注射CCl4可引起小鼠急性 肝损伤，模型组血清ALT、AST活性明显高于对照组 （p＜0.01），表明造模成功。GSGPs各剂量组ALT、AST 的含量显著低于模型组（p＜0.01），中、高剂量组的 GSGPs可显著抑制由CCl4造成的血清ALT、AST活性 升高。 CCl4经肝脏细胞内质网代谢，导致自由基增加， 影响生物结构或通过氧激活产生的三线态氧，对肝 脏产生损伤作用。CCl4肝损伤模型是典型的急性 肝损伤模型：CCl4经过肝微粒体细胞色素P450酶激 活，生成CCl3 ·，CCl3 ·与氧作用，形成具有更强活性的 CCl3COO·自由基，更为严重的在CCl3 ·启动的过氧化 自由基的连锁反应中，还可产生超氧阴离子（O2 - ·）和 羟阴离子（OH·）自由基，这些自由基更为严重的损 伤肝细胞各组分。谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶 （AST）是肝功能的重要指标，ALT与AST分别存在于 肝细胞浆以及肝细胞浆的线粒体中。肝细胞损伤时， 致使肝脏肿胀，ALT进入血中，当肝细胞严重损伤危 及至线粒体，AST也进入血中。CCl4急性肝损伤导致 血清ALT、AST活性明显升高。只要有1%的肝细胞坏 死，就可以使血清酶增高一倍，是检测肝细胞受损的 灵敏指标。自由基与肝细胞内的蛋白等进行结合，干 扰蛋白质合成，与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂 质过氧化反应以及氯烷化作用。初期引起肝脏膜性 损伤，使肝细胞膜的功能缺失，严重可导致肝细胞坏 死。实验结果表明GSGPs对由CCl4诱导的小鼠急性肝 损伤具有保护作用。 CCl4模型组造成小鼠机体的MDA含量比对照组 显著升高（p＜0.01），而GSGPs各剂量组MDA含量显著 低于模型组（p＜0.01），高剂量组的MDA含量低于对 照组。说明灌胃GSGPs可以减少小鼠血清中氧化产 物MDA产量。模型组SOD活性与对照对照组相比显 著降低（p＜0.01），而GSGPs中高剂量组的SOD含量显 著高于模型组和对照组（p＜0.01），说明灌胃GSGPs能 够提高小鼠肝组织中SOD活性。GSGPs高低剂量组小 鼠体内MDA含量显著降低，SOD活性显著升高。CCl4 急性肝损伤会同时导致超氧化物歧化酶（SOD）、谷 胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ）和谷胱甘肽（GSH）消耗 增加，使模型组SOD、GSH-PX活性和GSH含量明显降 低。文献表明肝脏炎症、免疫损伤以及癌变等肝损 伤，致使肝组织内SOD含量减少，血清中脂质过氧化 产物（MDA）含量增加。GSGPs各剂量组均表现出对 由CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。
2.2 GSGPs对CCl4处理小鼠肝组织学影响 正常组织肝小叶结构清晰，肝细胞索状排列规 则，肝细胞结构及形态正常。CCl4模型组肝细胞明显 肿胀变形，肝细胞索紊乱，伴有炎症细胞侵润，造成 不同程度的功能退化，肝动脉的纤维化以及主血管 的扩张以及阻塞。GSGPs低、中、高剂量组的肝细胞 索排列整齐，肝细胞排列规则，较模型组损伤明显减 轻。光镜结果显示，GSGPs能明显减轻CCl4对肝组织 的急性损伤。
临床上使用糖肽类中药结合保肝护肝类西药结 合的方法，防治炎症性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、肝 癌等肝病取得了良好的效果。糖肽护肝功能可以从 三个方面进行解释。一是糖肽能够有效清除自由基， 防止自由基对肝细胞进行攻击，使肝细胞发生脂质 过氧化，达到对肝损害保护的目的，这样的生物活性 物质有牛筋草提取物、羊栖菜糖蛋白、芦荟多 糖、桐棉叶提取物。二是糖肽等提取物能够改善 肝损伤实验小鼠模型的生理生化指标，例如复方枸 杞提取物改善肝损伤小鼠的肝脏组织状态，提高血 清中SOD，降低血清中ALT、AST，降低血清中总胆固 醇（TC）、甘油三酯（TG）指标，抑制细胞色素酶P450 活性，阻断自由基的产生，减轻由于过氧化而引起的 肝细胞膜、线粒体、溶酶体损伤导致的肝细胞坏死， 降低转氨酶，达到减轻肝损伤的效果。三是糖肽能够 促进免疫细胞DNA的合成，增强免疫应答，明显增殖 脾细胞及T细胞，有效提高机体免疫功能，如薄芝糖 肽联合干扰素治疗慢性乙型肝炎具有明显疗效，且 副反应少。
3 结论
本研究利用CCl4导致小鼠急性肝损伤模型，研究 了GSGPs对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用。结果 表明，GSGPs中（400mg/（kg·d））、高（800mg/（kg·d）） 剂量组可显著抑制小鼠肝脏组织中由CCl4造成的血 清中AST、ALT活性升高，明显降低肝组织MDA含量， 并且提高肝组织中SOD活性。同时，GSGPs各剂量组 的肝细胞索排列整齐、肝细胞排列规则，较模型组肝 组织损伤明显减轻。本研究表明，GSGPs具有减轻 CCl4对肝组织的急性损伤的作用。研究结果为更好 地开发利用GSGPs提供了一些基础数据。
