大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能调节作用的研究

免疫活性物质包括多糖、寡糖、多肽、核酸、留醇类、黄酮类等多种不同组成、不同分子量的物质，其来源广泛，包括动物、植物和微生物。免疫活性物质在医药、食品、饲料等领域有广泛的用途。不断发现和开辟免疫活性物质的来源是现代生物技术的一个研究热点。

大鲵是中国特有的二级保护动物。近年来，通过人工驯养繁殖，大鲵资源在湖南、浙江、陕西、河南、湖北已得到快速增长。大力发展大鲵深加工途径已经成为目前的一个重要任务。金桥等发现从大鲵皮肤黏液中制备的大鲵低聚糖肽具有清除羟自由基的作用，现明显的量效关系。李伟等发现大鲵低聚糖肽>i冇较强的抗疲劳作用。至于人鲵低聚糖肽对机体免疫机能的调节作用研究来见报道。笔者对大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能调节的影响进行了研究，进而为大鲵黏液的开发利用和将其开发成新的保健品提供实脸数据。

1 材料与方法

1.1试验材料

大鲵低聚糖肽，按李伟等方法，由辽宁省水产品加工及综介利用玉点实验室制备。
清洁级昆明种小鼠，体质W18-22g,雌雄各半，购自大连医科大学实验动物研究中心[SCXK(II)2008-0002],T12h黑Bg，12h光克的塑料饲养筘内养，室温（20±2)相对湿度，自由采食和饮水。豚鼠，体质量300~400g，构自大连眹科大学实验动物研究中心[SCXK(辽)2008-0002]。

1.2血清中lg测定

32只小鼠随机分为4组：对照组以及低、中、高3个剂量组。大鲵低聚糖肽溶于生理盐水中，毎天定时等体积灌胃1次，灌胃的大鲵低聚糖肽分别为0、0.01、0.05、0.1g(kg.bw),连续灌胃8d。最后一次灌服大鲵低聚搪肽后1h.摘眼球取血.将采集的全血于37°C恒温30min，然后于4°C冰箱屮1h，在3000r/inin下离心3min，分离血清，将抗小鼠IgG单抗溶液包被丁酶标板上，毎孔中加入100mL待测血济，37°C孵育2h。PBS洗板3次后，毎孔屮加入生物索标记的抗小鼠IgG单抗100μL.37°C孵育1h。PBS洗扳3次后，加人辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin）与生物素结合，加人酶底物（0.4mg/mL邻苯二胺和0.1mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液中的0.01%H₂O₂，pH5.0)。反应10min后，每孔加入50μL0,2mol/L的H₂SO4终止反应。在492mm处测定吸光值。通过标准曲线求出对应的IgG值。

1.3吞噬功能测定

小鼠分组及给药方法如1.2。最后1次灌服大鲵低聚搪肽1h,腹腔注人20%(v/v，牛理盐水配制）鸡红细胞悬液1ml。30min后，腹腔注射生理盐水，取腹腔液涂片，瑞氏染色，计数200个巨噬细胞.计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

1.4T淋巴细胞数置的测定

小鼠分组及给药方法如1.2。取小鼠新鲜血液0.5mL，置于载玻片上，吹干。在4°C的福尔4林-丙酮固定液中，固定1min。取出蒸馏水冲洗3min，吹干。用4%副品红盐酸溶液、4%亚硝酸钠溶液以及2%α-醋酸萘酯乙二醇甲醚溶液组成的孵育液于37°C孵育1.5h。孵痛后蒸馏水冲洗3min.用2%的甲基绿复染1min，油镜观察。计数200个T淋巴细胞，以胞浆内含有1个或数个棕红色颗粒者为，α-醋酸萘酯稱（ANAE)阳性淋巴细胞。

1.5统计学处理

用SPSS统计软件对实验数据进行处理，数值以（x±s)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1对血清中IgG的影响

连续灌胃8d，与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中IgG数量差异显著（P<0.05)，其中50mg/kg剂量组高出对照绗的2.5倍（图1）。IgG起着激活补体，中和多种毒素的作用，同时它也是反应机体免疫状态的重要指标。大鲵低聚搪肽可以显著增加小鼠的IgG数量。因此，它具有对正常小鼠体液免疫功能的促进作用。

2.2吞噬功能

试验结果显示，连续灌胃8d后各剂量组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数显著增多。计数200个巨噬细胞，其中50mg/kg剂量组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数达133个（图2）。大鲵低聚糖肽具有提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能。

2.3T淋巴细胞数数量测定

ANAE是T淋巴细胞溶酶体中重要的非特异性同工酶，ANAE阳件率反应T淋巴细胞免疫水平。从图3可以看出，连续灌胃8d后50mg/kg剂量组ANAE阳性率显著高于对照组（P<0.05）即大鲵低聚糖肽能增强小鼠的细胞免疫功能。

大鲵体表黏液主要由蛋质和寡糖链组成。李伟等利用动物蛋白酶和海洋微生物蛋白酶从大鲵体表黏液中制备出大鲵低聚糖肽。黄酮、小肽、多糖类作为免疫激活剂已有很多的报道，糖肽类物质属于肽类物质，与肽类不同的是它具N-乙酰半乳糖胺与丝氨酸或苏氨酸缩合形成的O-糖苷键或者N-乙酰葡萄糖胺与天冬酰胺缩合形成的N-糖苷键。研究表明，大鲵低聚糖肽具有O糖苷键结构。具有O-糖苷键结构的大鲵低聚糖肽增强免疫的机理还有进一步研究。

3 结论

该研究证明了不同剂量的大鲵低聚糖肽在给饲小鼠8d后，对照组相比较，低、中、高各剂量提高了小鼠的抗体生成量、吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数以及T淋巴细胞活性。提示大鲵低聚糖肽具有提高小鼠的免疫功能的作用。