金驰生物Logo

科研成果

专业论文 您现在的位置:首页 > 科研成果 > 专业论文

大鲵糖肽组分的高效液相色谱分析及其抗氧化活性研究

摘 要 :利用高效液相色谱 方法对大鲵糖肽进行 分析 ,使 用 SinoChrom Cs反相柱 和紫外 可变 波长检 测器 ,并测 定 大 鲵 糖 肽 的羟 基 自由基 清 除 能 力 。结 果 表 明 :大 鲵 糖 肽 组 分 的最 佳 液 相 色 谱 检 测 条 件 为 :检 测 波 长 280nm; 流 动 相 为 V(乙 腈 ):V (甲醇 ) :V(0.1 三 氟 乙 酸 ) 一5:5:90; 流 速 1_0mL/min;进 样 量 20μL。大 鲵 糖 肽 在 5.78 μg/mL浓度 时 ,羟 基 自由基 的 清 除 率 达 60.19 ,具 有 较 好 的 抗 氧 化 活 性 。 
关 键 词 :大 鲵 ;糖 肽 ;高 效 液 相 色 谱 ;抗 氧 化 活 性

大鲵俗称娃娃鱼(Andriasdavidianus),是世界上现存最大的也是最珍贵的两栖动物。大鲵既是国家二类保护水生野生动物,也是农业产业化和特色农业的重点开发品种,具有较大的开发利用潜力。国外学者对两栖类动物皮肤分泌物的研究已长达4O多年,报道了500多种活性肽。两栖类动物皮肤中含有的多种生物活性肽是生物活性肽的重要来源]。作者利用高效液相色谱方法(HPLC)对从大鲵皮肤粘液中制备的活性糖肽进行分析,建立了较为理想的大鲵糖肽的HPLC分离体系,同时,对大鲵糖肽的抗氧化活性进行了测定。


1 材料方法

1.1材料、试剂、仪器

大鲵糖肽,2009年9月由辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室提供,分子量≤4000,含糖量占27.6%(质量比)。
甲醇、乙腈、三氟乙酸(TFA)为色谱纯。
P230高效液相色谱仪,UV230+紫外检测器,SinoChromC18(5m,4.6mm×150mm)分析柱(大连依利特分析仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1色谱条件筛选将1rng大鲵糖肽溶解于lmL双蒸水中,进行全波长扫描确定检测波长。通过对流动相配比的顺序优化法进行分离条件的选择。

1.2.2大鲵糖肽的·oH清除活力测定采用改进的2一脱氧核糖(2一Deoxy-D—ribose)氧化方法L4]测定OH清除活力。将5mmol/LFeSO4,5mmol/LEDTA和5mmol/L2-Deoxy—D—ribose各0.2mL,与0.2mL不同浓度的大鲵糖肽混合,加入0.10mL后,再加人0.2mL的5mmol/LH2O2,37℃保温4h后,加入1.4TCA、0.5%TBA各1mL。反应混合物置于沸水浴中煮沸10rain。测定532nm处吸光值,抑制率按如下公式计算:抑制率

式中:C为标准液的吸光度值;CB为空白液的吸光度值;S为样品反应液的吸光度值;SB为对照液的吸光度值。


2 结果

2.1波长的选择经全波长扫描,发现大鲵糖肽在280nm处有较强吸收峰,因此选定280nm作为检测波长。

2.2流动相的组成对分离效果的影响采用混合液设计顺序优化实验方案。利用具有确定组成的多元混合溶剂的多重选择性,对一个分析任务进行分离条件的优化E。首先选择3种具有确定组成的二元混合溶剂流动相,构成等边三角形的3个顶点(图1),各点混合溶剂的体积分数组成如下:


图1顺序优化模型Fig.1Modelingfororderoptimizing
A点,(0.1TFA)一100,B点,(乙腈):V(0.1TFA)一30:7O,C点,(甲醇):V(O.1TFA)一40:60。

在A、B、C3种流动相中进行样品分析,图谱见图2。

图2  A、B、C3点顺序优化对应的HPLC图谱
Fig.2HPLCchromatogramofA,B,C
如图2所示,在A、B、C点流动相组成下,不能实现样品组分的分离,因此可选择三角形各边上的中点(固定组成的三元混合溶剂)以及中心点(固定组成的四元混合溶剂)所对应的流动相,进行上述样品分析。各点组成如下:
D点,(乙腈):(0.1TFA)=15:85,
E点,(甲醇):(0.1TFA)=20:80,
F点,(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=15:20:65,
G点,(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=10:13:77。

图3  D、E、F、G、H顺序优化对应的图谱
Fig.3HPLCchromatogramofD,EIF,G,H


由图3可以看到,在D、E、F、G点流动相组成下,样品组分不能完全分离。但通过7个点的图谱分析,可以看出F、G两点虽然没有将样品组分完全分离开,但其重合峰较少,并且样品各组分都有显现,因此应在两点之间去寻求实现样品组分完全分离的最佳混合溶剂的配比,经试验确定,H点可获较好的分离结果。
H点的组成为:V(乙腈):V(甲醇):V(0.1TFA)=5:5:90。从图3中可见,H点流动相组成下,大鲵糖肽中各成分已经达到了较好的分离效果。

2.3流速对分离度的影响按已选定的检测条件考察不同流速对样品各组分分离效果的影响,结果表明:随着流速的增大,样品的保留时间逐渐缩小,分离度降低,柱压升高;随着流速减小,保留时间延长,分离度增大,但流速小于0.2mI/min时,保留时间过长,且色谱峰变宽。为缩短分离时间,且保留良好的分辨率,选择流速为1.0mL/min。

2.4大鲵糖肽的·OH清除活力测定各浓度大鲵糖肽的·OH的清除率结果如图4。由图4可知,在0.58~5.78μg/mL内,随糖肽溶液浓度的增加,对羟自由基的清除率也随之增加,当溶液中活性肽的浓度为5.78μug/mL时,对·0H的清除率达到62%。Yang等从高原蛙类的皮肤中提取了多个家族的抗氧化肽,确立了在两栖动物中存在新的皮肤抗氧化系统。从大鲵皮肤黏液中制备的糖肽具有抗氧化活性,是两栖动物中存在新皮肤抗氧化系统的补充证据。

3 讨论

目前,有关活性多肽和蛋白质类药物在临床治疗和制药工业中的应用取得了快速发展,因此,建立一套完整的活性多肽分离纯化技术具有重要意义。该试验利用高效液相色谱,通过混合液顺序优化方法,实现了大鲵糖肽的有效分离。与其他分离纯化方法相比,高效液相色谱纯化体系具有分辨率和回收率高、操作简便、重复性好等优势,可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)等作为流动相,纯化产物不必脱盐,大大简化了操作步骤。虽然纯化的蛋白质会发生变性,但通过HPLC能得到该蛋白的结构特征及疏水性等信息,并可将其精确地与其他蛋白相区分。甘一如等利用高效液相色谱法分离纯化经化学合成的活性多肽药物胸腺素α1。吴亚丽等对高效液相色谱法在降血压肽分离与纯化中的应用进行了研究,并对其分离条件进行了优化。肖向红等建立了东北林蛙皮肤活性抗菌肽的高效液相色谱纯化体系。两栖动物皮肤分泌物中主要含有四大类生物化学成分,即生物胺、蟾蜍配基、生物碱、多肽与蛋白质。其中多肽的种类和数量特别丰富,因此,两栖类生物又被称为生物活性多肽资源的巨大贮存库。当前有关两栖动物皮肤黏液的研究有很多报道,但多集中于蛙类两栖动物活性抗菌肽的研究,有关大鲵皮肤活性物质的研究未见报道。在此研究中,大鲵糖肽的体外抗氧化活性结果表明,大鲵皮肤活性糖肽具有清除羟自由基的作用,并且呈明显的量效关系。这些结果既丰富了两栖动物皮肤分泌物的研究,也为大鲵糖肽的利用提供了基础数据。