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大鲵低聚糖肽安全性的毒理学初步研究

摘 要: 目的 研究大鲵低聚糖肽的安全性。方法 采用小鼠急性经口毒性实验、小鼠骨髓细胞微核实验和大鼠 30 d 喂养实验, 评价大鲵低聚糖肽的安全性。结果 雌、雄性小鼠急性经口在 11764.7 mg/kg·BW剂量时, 未见毒性不良反应, 根据急性毒性剂量分级标准, 大鲵低聚糖肽属于无毒级; 大鲵低聚糖肽无致小鼠骨髓细胞微核效应, 30 d 喂养实验未见大鼠的生长发育、生物化学指标、脏器/体质量比值比及病理学变化。结论 毒性实验未见大鲵低聚糖肽产生明显毒副作用。

关键词: 大鲵; 低聚糖肽; 毒性; 小鼠; 大鼠

1 引 言

大鲵(Andrias davidianus)属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科, 是我国特有的珍稀物种, 属国家二类保护动物, 主要分布于长江中上游、珠江中上游及汉水上游的溪流中。20 世纪 90 年代以来, 大鲵的人工养殖技术取得了重大突破。目前, 全国大鲵人工繁殖单位已达 100 余个, 年人工繁育大鲵幼苗达 10 余万尾, 2015 年大鲵养殖总量已接近600 万尾。因此, 为了提高大鲵养殖业的经济效益, 大鲵的精深加工成为十分紧迫的任务。大鲵皮肤表面具有丰富的黏液腺和颗粒腺, 这些腺体能分泌大鲵黏液。Qu等利用 Aspergillus sp.酸性蛋白酶酶解大鲵体表黏液,获得了分子量小于 3500 Da 的大鲵低聚糖肽。佟长青等利用冷冻浓缩工艺获得了大鲵低聚糖肽粉。曲敏等利用昆明种小鼠研究了不同剂量的大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响, 发现它对小鼠体液免疫功能具有促进作用。进一步研究发现大鲵低聚糖肽还具有体外抗氧化活性、对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用、抗疲劳作用、保湿作用、抑菌、抗血小板聚集活性以及抗光老化作用。目前, 大鲵低聚糖肽已经成为一种新型的生物活性物质, 在食品、药品、化妆品以及科学研究中具有广泛的应用。
来源于大鲵体表黏液的大鲵低聚糖肽, 并不是传统的食用材料, 也一直未见其安全性研究报道。本研究根据中华人民共和国《食品安全性毒理学评价程序》设计了大鲵低聚糖肽经口小鼠急性毒性实验、小鼠骨髓细胞微核效应、大鼠 30 d 喂养实验。本文对大鲵低聚糖肽的安全性研究, 为大鲵低聚糖肽的开发利用提供了安全性依据。

2 材料与方法

2.1 材 料

大鲵体表黏液由张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司提供。大鲵低聚糖肽按照 Qu 等方法制备。周清洁级 ICR 小鼠, 体质量为 18~22 g, 雌雄各半, 购自大连医科大学实验动物研究中心。SD 大鼠, 雌雄各半, 雌性动物初始体重 66~80 g, 雄性动物初始体重 71~89 g, 购于上海西普尔必凯实验动物有限公司。实验动物于 12 h黑暗、12 h 光亮的塑料饲养箱内饲养, 室温(23±2) ℃, 湿度40%~60%, 自由采食和饮水。动物饲料购自北京华阜康生物科技有限公司, 许可证号 SCXK(京)2016-0011。实验动物生产许可证号 SCXK(辽)2008-0002, 实验动物使用许可证号 SYXK(辽)2008-0002。

2.2 实验方法

2.2.1 急性经口毒性实验

大鲵低聚糖肽以无菌水配制成 0.1 g/mL。ICR 小鼠 20只, 雌雄各半, 于第一次给药前禁食 12 h, 不限制饮水。采用灌胃途径给药。小鼠按 20 g/kg·BW 给予无菌水配制的大鲵低聚糖肽溶液。24 h 内给药3次, 每两次间隔8h。给药结束后观察 7 d。实验结束后全部小鼠脱颈处死, 解剖检查心、肝、脾、肺、肾的病理变化。

2.2.2 小鼠骨髓细胞微核效应

选ICR小鼠50只, 随机分成5组。设置3个剂量组, 高剂量设置为 10 g/kg·BW, 中剂量设置为 5 g/kg·BW, 低剂量设置为 2.5 g/kg·BW, 按 20 mL/kg·BW 灌胃; 实验同时设置溶剂对照组、环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg·BW, 腹腔注射)。采用 30 h 给予受试物法, 即两次给予受试物间隔 24 h, 末次给予受食物后 6 h, 脱颈处死动物, 制备骨髓标本。
取胸骨或股骨, 止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀, 常规涂片, 涂片自然干燥后放入甲醇固定5~10 min, 保存或继续后续染色。固定好的片子放入Giemsa 染色工作液中, 染色 10~15 min, 立即用 pH 6.8 的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。写好标签, 阴凉处保存, 或直接镜检。阅片采用双盲法, 计数每只动物 200 个红细胞中的嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte, PCE), 计算其所占比例; 每只动物观察计数2000个嗜多染红细胞中微核细胞数, 微核发生率以千分率计。

2.2.3 30d 喂养实验

取SD大鼠80只, 雌雄各半, 雌性动物初始体重66~80g, 雄性动物初始体重71~89 g。设置3个剂量组, 高剂量设置为 10 g/kg·BW, 中剂量设置为 5 g/kg·BW, 低剂量设置为2.5 g/kg·BW, 按 20 mL/kg·BW灌胃。另设置一个对照组。连续喂养 30d。每天观察大鼠情况。每周称大鼠体质量和饲料质量, 计算增重、进食量和食物利用率。实验结束时对大鼠进行血液学、肝功能指标和肝、脾脏器系数测定, 并进行病理学检查。

2.2.4 统计学处理

用 SPSS 统计软件对实验数据进行处理, 数值以(X±SD)表示。P<0.05 为差异显著。

3 结果与分析

3.1 急性经口毒性实验

急性毒性实验结果表明, 大鲵低聚糖肽整个急性毒性实验过程中小鼠未出现死亡, 未见毒性不良反应。实验结束时剖检结果也未见病理变化。为了灌胃, 在满足流动性前提下, 配制最大药物浓度 0.1 g/mL。结果显示大鲵低聚糖肽对 ICR 种雌、雄小鼠的急性经口毒性耐受剂量在11764.7 mg/kg·BW 时, 未见毒性反应。因此, 大鲵低聚糖肽属于实际无毒级物质。

3.2 骨髓红细胞微核实验

由表 1 可见, 阳性对照组与溶剂对照组相比有极显著统计学差异(P<0.01), 阳性对照成立; 大鲵低聚糖肽各剂量 PCE 百分比未少于溶剂对照组的 20%, 表明大鲵低聚糖肽在实验剂量下无明显细胞毒性; 大鲵低聚糖肽各剂量组的微核发生率与溶剂对照组相比, 均无统计学差异(P>0.05), 提示大鲵低聚糖肽对小鼠骨髓细胞无致微核作用。

3.3 30d 喂养实验

3个剂量组, 高剂量设置为 10 g/(kg·BW·d), 中剂量设置为 5 g/(kg·BW·d), 低剂量设置为 2.5 g/(kg·BW·d), 相当于人体(60 kg 体重)每天吃 1851.85、925.93、277.78 g。各剂量组大鼠喂养过程中进食、活动均正常, 生长发育良好, 无中毒及死亡现象。实验结果表明, 大鼠体质量、增重、进食量和食物利用率与阴性对照比较, 差异无统计学意义(P>0.05)(表 2)。各剂量组的血液学指标、功能指标和肝、脾脏器系数 , 差异无统计学意义(P>0.05)(表 3、表 4 与表 5)。解剖及病理检查, 未见有异常及病理学改变。这表明, 大鲵低聚糖肽对大鼠无损害作用。

4 结论与讨论

大鲵低聚糖肽通过利用 Aspergillus sp.酸性蛋白酶酶解大鲵体表黏液制得。大鲵低聚糖肽的分子量低于 3.5 kDa, 其成分中总蛋白含量为 80.01%, 总糖含量为 15.15%, 总糖中含有盐酸氨基葡萄糖最高、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和唾液酸。氨基酸分析结果表明, 大鲵低聚糖肽中所含有 18 种氨基酸, 除色氨酸未测出外, 人体其它 7 种必需氨基酸的含量较高, 其中苏氨酸(Thr)含量最为丰富, 高达13.1%。同时, 大鲵低聚糖肽具有多种多样的生物活性。因此, 大鲵低聚糖肽具有在食品、医药等领域的潜在的应用价值。

为了确保大鲵低聚糖肽的食用安全性, 根据中华人民共和国《食品安全性毒理学评价程序》的规定, 考察了大鲵低聚糖肽经口小鼠急性毒性实验、小鼠骨髓细胞微核效应、大鼠 30 d 喂养实验。大鲵低聚糖肽经口小鼠急性毒性实验以及小鼠亚急性毒性实验表明大鲵低聚糖肽属于无毒级。小鼠骨髓细胞微核效应、大鼠 30 d 喂养实验以及解剖及病理检查均未见异常。因此, 在本研究的剂量范围内大鲵低聚糖肽毒理学是安全的, 可以进一步开发大鲵低聚糖肽在食品及药品领域的应用。