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间接酶联免疫吸附法则测定大鲵凝集素

摘要:[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1:16000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1:3000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1:30000,抗原浓度在31.25~1000.00ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数R²>0.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。

关键词:大鲵;凝集素;酶联免疫;多克隆抗体

大鲵俗称“娃娃鱼”,属两柄纲有尾 目隐鳃銳科,是世界上现存最大的两柄动物,也是国家二级 保护动物,主要分布于我国的长江、黄河、珠江中上游支流的 山润溪流。经人工养殖的子二代大鲵在医药保健、美食及 观赏等方面都具有非常高的开发应用前景。经过30余年 的发展,我国大鲵养殖已积累了一定的经验,但对于大鲵病 害的发生及大鲵自身免疫系统的研究相对滞后。大鲵在 生长过程中出现腹胀、腐皮病、烂尾病和皮肤溃烂等与自身 免疫功能下降相关的疾病给大鲵养殖业带来了巨大的经济 损失。因此,对于大鲵免疫系统中免疫因子的表达水平 与大鲵健康状况的研究显得尤为重要。

凝集素作为天然免疫因子中重要的一环,在生物体微生 物感染、病原识別、调理、吞噬,机体防御等方面具有极为重 要的作用,其含量与生物体自身的健康状态密切相关。 生物体受到外来致病微生物的人侵时,机体启动免疫应答, 第1步是病原与宿主免疫因子间的识別,脊椎动物的凝集素 途径是补体激活途径中重要的一部分。已有研究表明, 生物体在大量细菌感染后的急性应答期,巨噬细胞经诱导产 生IL- 6 , 进 而 促 使 肝 细 胞 合 成 包 括 甘 露 糖 结 合 凝 集 素 (MBL),此时血清中MBL含量明显增加,因此MBL在血清 中含量的高低将直接影响生物体免疫防御功能的发挥,可以作为衡量生物体健康状况的一个有效指标。因此,笔者 利用大鲵凝集素(ADL)免疫新西兰白兔,制备大鲵凝集素蛋 白多克隆抗血清,建立大鲵凝集素间接ELISA检测方法,证 实该ELISA方法的可行性,并对大鲵样本中的头部、躯干和 尾部肌肉组织中的ADL含量进行测定,了解其在大鲵体内3 个不同部位表达的情况,为后续进一步研究ADL的表达水 平与大鲵患病状况之间的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

大鲵凝集素ADL参照伽等的方法制备。主 要试剂:弗氏完全佐剂及弗式不完全佐剂,Sigma;牛血清白 蛋白及卵清蛋白,Solarhio; BCA法蛋白定量试剂盒,青岛捷 世康生物科技有限公司;封闭液和TMB显色液,北京梅科万 德生物科技有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,北京康成生物工程公司。包被液:0. 05 mol/L、PH 9.6的碳 酸钠-碳酸氢钠缓冲液;稀释液:0. 01 mol/L磷酸盐缓冲液; 洗涤液:含0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液;终止液: 2mol/L的 H2S04 溶液。

1.2 方 法

1.2.1 兔多克隆血清的制备。该试验以雄性新西兰大白兔为免疫对象,月龄3个月,体重1.5 kg,购于大连医科大学动 物实验中心。免疫前于耳缘静脉采血制备免疫前血清,即阴性血清。取0. 5 mg大銳凝集素溶于0. 5 mL生理盐水,加人 等体积弗氏完全佐剂后充分混合,制成0. 5 mg/mL的抗原乳 化液,待乳化完全后于兔颈背部皮下多点注射,此后将弗氏 完全佐剂更换为弗氏不完全佐剂,以同样剂量及免疫方式每 14d免疫1次,共免疫4次,末次免疫后7d大量采血,采集到的血液于4ºC冰箱中过夜,3 000 r/min离心15 min,取h 清,分装后于-20ºC 保存备用。

1.2.2 凝集素ADL多克隆抗体效价测定。用包被液将凝集 素ADL按100μL/孔,4ºC 过夜包被酶标板;包被结束后洗涤 液洗板3次,200μL孔;加人封闭液封闭酶标板,200 μL/孔, 37 ºC 封闭1 h;封闭结束后洗涤液洗板3次,将兔多克隆血清 从1: 100倍开始倍比稀释,100μL/孔,37ºC 反应1 h,同时做 阴性对照;反应结束后重复洗板3次,加入1: 20 000倍稀释 的HKP标记的羊抗兔二抗,37ºC 反应1 h;反应结束后加人 TMB显色液,100 μL/孔,37 ºC 避光反应20 min;最后按 50 μL/孔加人终止液,在波长450 nm下使用酶标仪读取吸 光度。以阳性血清/阴性对照(P/N)≤ 2. 1,且OD450≥ 0. 1,此 时的抗体稀释倍数即是该抗血清的效价。

1.2.3 方阵法测定抗原抗体的最适稀释度。为了获得最佳 的测定条件及节约试剂用量,该试验采用方阵法对ADL的 包被量及血清多抗稀释倍数进行优化,横列将凝集素抗原溶 液用包被液从1: 1 600到1: 51 200倍比稀释,稀释成6个不 同浓度的稀释液,包被酶标板;纵列将血清多抗按照1: 400 倍到1: 12 800倍倍比稀释,二抗用稀释液按1: 30 000倍稀 释,进行间接非竞争酶联免疫检测。

1.2.4 间接非竞争酶联免疫程序。在酶标板内包被ADL, 100 μL/孔加入96孔酶标板,4 ºC包被过夜;包被结束后倒去 包被液,洗涤液洗板3次,200 μL/孔;加人封闭液封闭酶标 板,200 μL孔,37 t封闭1 h;封闭结束后洗涤液洗板3次, 加入1:3 000倍稀释的抗血清,37 ºC反应1 h;反应结束后重 复洗板3次,加入1: 30 000倍稀释的HRP标记的羊抗兔二 抗,37 ºC反应1 h;反应结束后加入TMB显色液,100 μL/孔, 37 ºC避光反应20 min;最后按50μL/孔加人终止液,在波长 450 nm下使用酶标仪读取OD 值。

1.2.5 重复性试验。该试验以板内差异和板间差异来确定该方法的重复性。在线性范围内取7个浓度(1000.000〜15.625ng/mL)的抗原溶液包被酶标板,每板设置6个反应孔,按步骤“1.2.2”进行EUSA测定,由OD450nm值计算出OD平均值及标准差(SD)),由公式CV%=(SD/OD平均值)x100%计算板内变异系数,用同样的方法在另外3块酶标板上重复试验,根据〇D450nm计算板间变异系数。

1.2.6 添加回收率测定。在PBS缓冲液中分別加入1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50μL/mLADL,用PBS缓冲液适当稀释后每个样品取6个平行,ELISA法测定其回收量,计算回收率。

1.2.7大鲵样本ADL测定。分別取9只大鲍,编号1~9,取大鲵头部、躯干、尾部肌肉组织,均质后取20g加生理盐水100mL,4ºC下抽提过夜,抽提液9000r/min离心10min,取上清液用于测定。取1mL上清液稀释10倍后使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度,根据标准曲线计算蛋白质质量;将上清液稀释1000倍后取100μL包被酶标板,进行ELISA测定,由标准曲线计算ADL浓度,最终得出样品中ADL的质量。每个样本重复测定3次,结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 凝集素ADL多克隆抗体效价以纯化好的凝集素为免疫原,0.5mg/只颈背部皮下多点注射免疫新西兰兔,于末次免疫7d后大量采血,获得抗血清。以ADL为包被抗原,采用间接ELISA法对抗血清效价进行检测,测得抗血清效价为1:16000。

2.2 抗原抗体最适稀释度适当的血清稀释度能够降低血清中的干扰物质,增加方法的灵敏度,较高的抗原稀释倍数可以节约试剂。从表1中可以看出,在抗原稀释度为1:6400,抗血清稀释倍数为1:3200时,吸光度值为1.161,符合棋盘滴定法中吸光度值在1附近为宜的原则,因此可以确定为最佳的稀释度。

2.3 间接ELISA标准曲线的建立将配制的400μL/mLADL抗原溶液,从1:400倍比稀释至1:25600,包被96孔酶标板,按步骤“1.2.2”的酶联免疫程序进行试验,以浓度的对数为横坐标,吸光度值〇D450为纵坐标,得到间接非竞争酶联免疫测凝集素的标准曲线,结果见图1。由图1可见,在31.25~1000.00ng/mL蛋白浓度范围内,凝集素浓度的对数值和吸光度之间具有较好的线性关系。

2.4 重复性 从表2可以看出,该方法重复性较好,板内变异系数为0. 92% ~ 9. 68%,板间变异系数为1.57% ~ 12. 35%,均小于15. 00%,达到ELISA测定方法的质量控制 要求。

2.5 回收率 由表3可见,在6次试验中,5个添加量的回收率误差均在15%的范围内,满足了 ELISA方法的测定要求。

2.6 大鲵样本测定结果 ELISA测定的结果显示(表4),大鲵凝集素在大鲵的头部、躯干及尾部的肌肉组织中均有分布,在躯干部的含量相对较高,不同大鲵之间相同部位的ADL含量分布范围较小。方法检测到ADL占抽提总蛋白的质量分数分別为头部(2. 12 ±0. 11)%,躯干(2. 09 ±0.12)%,尾部(2.05 ±0.08)%,总体相差不大;9只大鲵不同身体部位中ADL质量分布范围分別为头部(19. 51 ±0. 81)~(22.86 ±0.84) mg,身K干(24.24±0.57) ~ (27.72 ±0.58)mg,尾部(IT 33 ± 1.30) ~ (19. 86 ± 0.51) mg(取不同部位样品质量均为20 g),含量为躯干 > 头部 > 尾部,头部和尾部中ADL含量不具有差异性(P>0. 05),在躯干部的表达含量明显高于头部及尾部,具有显著性差异(P < 0. 05)。该结果可能是因为两柄动物躯干部占整体的比例较大,拥有更大的体表面积,且内部包含胸腺、骨髓、脾脏等其他主要免疫器官以及分布于相关组织器官的淋巴组织,因此在相近的肌肉组织中会有较高的含量。周旋等在研究了两柄动物中的东北林蛙在受到彩虹病毒胁迫下,参与先天免疫的模式识別分子NF-kB和I-kB在其皮肤、肝脏和脾脏中的表达情况,结果表明东北林蛙的皮肤能够分泌出抑制微生物活性的物质,成为抵抗病原微生物人侵的第1层屏障,并在病毒刺激的后期,该模式识別分子NF-kB在皮肤和肝脏中的表达上调,表明在两柄动物的先天性免疫中,皮肤中的模式识別分子会在致病微生物感染的初期起到抵制作用,而在刺激的后期,脾脏则担负起了主要的免疫调控作用。凝集素同样作为先天性免疫中的一种重要模式识別受体,在机体生长发育的过程中可能也会起到相似的免疫调节作用。

3 结论与讨论
目前,大鲵已经实现了人工养殖,且养殖规模也在逐年扩大,一些养殖企业对于大鲵在养殖过程中出现的病害问题,也只是采用改善机体营养和养殖条件的方式去应对,并未对大鲵自身免疫分子进行深人的研究,无法科学有效地避免大銳非正常死亡,因此最终会造成经济损失。

凝集素作为一大类对特定多糖具有亲和力的多价糖蛋白,广泛分布于皮肤黏液、血液及组织器官中,在抵御致病微生物人侵的第1阶段即“自己”和“非己”识別阶段发挥重要作用。因此从大鲵自身免疫系统着手,对其中具有的免疫活性物质进行研究,开发基于酶联免疫反应的大銳凝集素检测试剂盒,对于研究大銳凝集素在其体内不同组织中的分布特征及表达水平与大銳健康状况之间的关系,将具有一定的实际意义。该试验使用从大鲵体表黏液中分离纯化的大鲵凝集素(ADL)作为为完全抗原,免疫新西兰A兔,成功制备出高效价的多克隆抗体,确定了抗原抗体的最佳稀释倍数,建立了检测ADL含量的间接ELISA标准曲线,并对该方法的重复性及添加回收率作出评价,证实该方法的可行性,最后通过建立的ELISA检测方法对大鲵样本进行检测,确定其在生物体内不同部位的分布。在今后的研究中,人们可结合单克隆抗体制备及免疫组化技术,扩大检测样本的选取范围,如血液样本及更容易采集到的体表黏液等,确定健康大鲵中ADL的分布范围,对低于正常值下限的大鲵及时采用合理的治疗手段,降低大鲵的非正常原因死亡数量,减少养殖企业的经济损失。