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大鲵皮胶原蛋白肽的结构特性及其对乙醇诱导肝损伤小鼠的保护作用

摘要:研究了大鲵皮胶原蛋白肽结构特性及其对乙醇诱导肝损伤小鼠的保护作用。大鲵皮经胃蛋白酶水解制备胶原蛋白,经木瓜蛋白酶水解制备大鲵皮胶原蛋白肽。紫外光谱及红外光谱结果表明,大鲵皮胶原蛋白肽具有胶原蛋白的三股螺旋结构。SDS-PAGE结果表明大鲵皮股原蛋白肽分子量低于55ku。大鲵皮胶原蛋白肽低(50mg/(kg•d)、高(150mg/(kg.d))剂量组可显著抑制小鼠乙醇诱导产生的血清中AST、AI,T活性的升高,显著抑制肝组织MI)A含量升高,并且抑制肝组织中SOD活性的下降。组织病理表明,乙醇诱导肝损伤模型组小鼠肝细胞明显肿胀变形,肝细胞索紊乱,伴有炎症细胞侵润,大鲵皮胶原蛋白肽各剂量组的肝细胞排列规则、肝细胞索清晰。结果表明,大鲵皮股原蛋白肽具有保护乙醇诱导小鼠肝损伤的作用。

关键词:大鲵,皮肤,胶原蛋白肽,乙醇,肝损伤

酒精性肝损伤足一种较为普遍的世界性疾病。 酒精对人体各个系统如:血液系统、消化系统、中枢神经和心血钤系统等产生不同程度的脏器损伤。急性酒精忡肝损伤足由于机体短吋叫摄入大量的乙醇,经机体氧化代谢产生乙醛对肝脏组织的脂肪代谢造成影响造成的。同吋,机体乙醇代谢大量产生的氧自由基等自由基,造成肝脏细胞膜的脂质过氧化,导致损伤肝组织,进而严重影响肝脏蛋白质、碳水化合物等物质代谢。针对这一问题,人们致力于从天然食物和药物中寻找对酒精肝损伤具侖保护作用的活性物质。玉米肽、灵芝肽、牛蒡菊糖等相继被报道其对酒精性肝损伤具有保护作用。这些结果表明,肽类、多糖类物质足对洒精肝损伤具侖保护作用活性物质的潜在来源。

大鲵(Andrias davidianus)为国家二级保护动物。自1999年农业部将大鲵列为重点开发的养殖品种以来,大鲵人工繁育、养殖技术获得了重大突破。2012年大鲵养殖量已经突破330万尾。因此,对于大鲵的精深加工成为目前的一个紧迫任务。目前,未见大鲵胶原蛋白肽肝保护作用的研究。本文研究大鲵加工副产物大鲵皮制备的胶原蛋白肽对乙醇诱导肝损伤小鼠的影响,探讨大鲵皮胶原蛋白肽对乙醇诱导肝损伤小鼠的保护作用,以期为大鲵产业化副产物的利用提供一定的依椐。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

大鲵皮 张家界(中国)金驰大鲵牛物科技有限公司;清洁级昆明种小鼠(体质量18~22g,雌雄各半)人连医科大学实验动物研究中心[SCXK(辽)2008-00021];胃蛋白酶(10OOOU/g)、木瓜蛋白酶(500000U/g)、SDS(AR)、β-巯基乙醇、溴酚蓝 北京索莱宝科技有限公司;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒以及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;硫普罗宁 河南竹新谊药业股份有限公司。

BS110S分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;GI,-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机;TU-1810紫外吋见光光度计 上海光谱仪器有限公司;85-1电磁搅拌器金坛市医疗仪器;FD-1冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶法提取大鲵皮胶原蛋白参照文献的方法:将大鲵皮解冻,去除皮下脂肪,剪成5mmx5mm小块,加入5%NaCl水溶液浸泡24h,除去非胶原蛋白成分。蒸馏水洗涤两次,加入0.5mol/L乙酸溶液(料液比1:20)以及加入匀浆液0.5%的胃蛋内酶,4ºC:溶胀12h。溶胀后的人鲵皮,组织捣碎,得到人鲵皮匀浆。匀浆液4ºC磁力搅拌提取36h。过滤,滤液9000r/min,离心30min。上清液为大鲵皮酸溶性胶原蛋白粗溶液。上清液中加入NaCl,至NaCl最终溶液浓度为0.9mol/L,过夜,离心收集沉淀。沉淀溶于0.5mol/L乙酸溶液,先用Na2HPO4透析液透析2d,再用蒸馏水透析2d。冻干得大鲵皮酸溶性胶原蛋白。

1.2.2 人鲵皮胶原蛋白肽制备人鲵皮胶原蛋白浓度30mg/mL,pH调至6.5,加入0.1%木瓜蛋白酶,水浴温度45ºC:反应4h。反应结束后,大鲵皮胶原蛋白酶解液100ºC,加热10min灭酶。过滤,滤液冷冻干燥得大鲵皮胶原蛋白肽样品。

1.2.3 SDS-PAGE电泳根据Laemmli的方法,分制备10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定大鲵皮胶原蛋白与大鲵皮胶原蛋白肽。

1.2.4 大鲵皮胶原蛋白、大鲵皮胶原蛋白肽紫外光谱测定 提取的大鲵皮胶原蛋白及胶原蛋门肽样品溶于0.5mol/L乙酸溶液,配制lg/L溶液。10000r/min,离心30minₒ测上清液200~4000nm紫外吸收光谱。

1.2.5大鲵皮胶原蛋白肽红外光谱测定将样品与KBr压制成片,扫描500~4000cm波长范围的光谱吸收值。

1.2.6 肝损伤小鼠及给药 选昆叨种小鼠50只,随机分成空白对照组、模型对照组和硫普罗宁阳性对照组(50mg/kg.d),大鲵皮胶原蛋白肽低浓度(50mg/kg.d)、高浓度(150mg/kg.d)剂量组,每组10只,于12h黑暗,12h光亮的塑料饲养箱内饲养,室温(20±2) ºC,湿度40%~60%,自由采食和饮水。各给药组每天灌胃1次,连续2周。对照组和模型组给予同样量的生理盐水,于每次给药3h后,除空白对照组外,各组均灌胃56度商品二锅头16mL/(kg.d)。各组均于末次给药后禁食不禁水。

乙醇肝损伤小鼠于末次给药16h后,断头取血,在30min内,3500r/min,离心5min后得上层血清备用。

快速处死小鼠取肝脏,并在肝左叶组织取约0.3g放冰冷的生理盐水中漂洗,取出后用滤纸将水吸干,制成10%肝组织匀浆液(生理盐水的休积总量是组织块体积的9倍),制备好的10%的肝组织匀浆液在低温低速离心机中以2000r/min左右离心10~15min,将离心好的匀浆保留上清液弃沉淀待测。

1.2.7 生化指标检测与病理学观察 血清屮谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)活性,肝脏组织中丙二醛(MDA)含量,超氧化物岐化酶(SOD)活性,蛋白质含量均按试剂盒的要求进行测定。处死小鼠后,取肝脏右叶组织约0.3g,用10%的屮性甲醛溶液进行固定,石蜡包埋切片。苏木精-伊红(HE)染色,在显微镜下进行病理学观察。

1.2.8 统计学处理用SPSS统计软件对实验数据进行处理,数值以表示。

2 结果与分析
2.1 大鲵皮胶原蛋白肽结构特性
  由图1可见,所提取的大鲵皮胶原蛋白具有α1、α2和β组分,属于典型的I型胶原蛋白。大鲵胶原蛋白分子量大于lOOku。大鲵皮胶原蛋白经木瓜蛋白酶酶解,获得的大覲胶原蛋白肽分子量低于55ku。

通过紫外光谱研究发现,大鲵皮胶原蛋白和胶原蛋白肽均在234nm处出现特征吸收峰(图2)。这表明大鲵皮胶原蛋白和胶原蛋白肽具有近紫外肽键C=O中的电子n->π*跃迁叫提取的胶原蛋白和胶原蛋白肽具有和似的紫外吸收光谱,说明木瓜蛋白酚酚解大鲵皮胶原蛋白时没有破坏其中具有紫外吸收特征的结构,即大鲵皮胶原蛋白肽仍然符合胶原蛋白的紫外吸收基本特征。

大鲵皮胶原蛋白及胶原蛋白肽红外光谱如图3所示。大鲵皮胶原蛋白(图3A)和大鲵皮胶原蛋白肽(图3B)分别在3320.81,3292.61cm-¹处具有吸收峰,表明分子中N-H参与氢键缔合;在3081.73和3080.55-¹处是酰胺B带C-N伸缩振动产牛的吸收峰;在2929.34、2961.86cm-¹处吸收峰由于酰胺B存在CH2;在1653.26. 1655.44cm-¹处有强峰由于酰胺I带的C-O伸缩振动产生的;在1540.66、1548.25cm-¹处具有吸收峰,是由于酰胺II带存在的N-H弯曲振动产生的吸收,与胶原蛋白酰胺II在1500~1600cm-¹有C-N伸缩振动以及N-H弯曲振动产生的吸收峰,本质为α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲叠加形成吸收带,同时Arg, Asp, Glu和Tyr侧链在此区域也有吸收。大鲵皮胶原蛋白(图3A)和大鲵皮胶原蛋白肽(图3B)在1451.56和1451.63cm-¹处由于存在CH2弯汕产生吸收;在1238.29和1245.60cm¹处存在酰胺III的N-H以及N-H变形出现的吸收峰;在1079.28和1083.15cm-¹处吸收峰是由于C-O, C-N-C振动产牛的;在1653.26和1655.44cm-1处出现三股螺旋内部形成氢键的C=O振动产牛的吸收峰;在1238.29和1245.60cm-1处的吸收是由于甘氨酸及矩脯氨酸形成特有的Gly-Pro-Hyp氨基酸序列出现的红外特征光。

由此可见,提取的大鲵皮胶原蛋白和大鲵皮胶原蛋白肽均具有三股螺旋结构。胃蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解没有破坏胶原蛋白中具有的三股螺旋结构,但胶原蛋白肽的分子量明显变小,说明酶解过程是横向水解大鲵皮胶原蛋白。大鲵皮胶原蛋白肽是具有三股螺旋结构的小分子胶原蛋白分子。这对其具有更好的溶解性及牛物活性具有重要作用。

2.2大鲵皮胶原蛋白肽对乙醇诱导肝损伤小鼠的影响

昆明种小鼠经过每天灌胃大鲵皮胶原蛋白肽,连续2周后断头取血分析其生物化学指标,以确定其对乙醇诱导肝损伤小鼠的影响。结果如表1所示,饲喂大鲵皮胶原蛋白肽组的ALT、AST明显小于乙醉模型组(P<0.01)。大鲵皮胶原蛋白肽低剂量及高剂量组与乙醇模型组肝组织中MDA含量相比显著下降(p<0.01)。大鲵皮胶原蛋白肽低剂量:及高剂量组SOD含就均高于乙醉模型组肝纽织中的SOD含量。

各实验组的肝脏组织病理变化如图4所示。对照正常的肝纽织切片,乙醉模型组肝细胞出现肿胀,出现大小不等的脂肪滴,伴有炎症细胞浸润;硫普罗宁对曲组,基木与正常肝组织一致,肝细胞结构清晰,形态较正常;大鲵胶原蛋白肽低剂量纽肝组织轻微损伤,肝细胞轻微肿胀,脂肪滴空泡较乙醉模型组轻;大鲵胶原蛋白肽高剂量组肝组织细胞正常,肝索排列整齐,与正常肝组织细胞差别不大。牛物化学指标及组织病理结果表明,大鲵胶原蛋白肽具右明显减轻乙醇对肝组织的急性损伤的作用。

3 结论

本研究以大鲵皮为原料制备大鋭皮胶原蛋白肽,经紫外光谱及红外光谱结果表明,大鲵皮胶原蛋白肽具有胶原蛋白类似的三股螺旋结构。SDS-PAGE。

结果表明其分子量低于55ku。大鲵皮胶原蛋白肽低、高剂量组显著抑制乙醇导致小鼠血清中ALT、AST活性升高,减少肝脏氧化产物MDA的产生,抑制乙醇导致的肝脏中SOD活性下降。组织病理表明,大鲵皮胶原蛋白肽低、高剂量组的肝脏细胞排列整齐,肝索清晰,脂肪滴空泡减轻,较乙醇模型组肝损伤显著减轻。大鲵皮胶原蛋白肽具有减轻酒精诱导小鼠急性肝损伤的作用。