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大鲵肉酶解产物的制备及其抗氧化性的研究

摘要:以大鲵肉为原料,利用Aspergillus sp.酸性蛋白酶进行酶解,研究其最佳的酶解条件以及酶解产物的抗氧化怍用。结果表明,大鲵肉酶解的最佳工艺条件为Aspergillussp.酸性蛋白酶加酶量为0.4(质量比)及底物浓度为0.1g/mL时,酶解时闻5.5h,pH2.0,温度45℃。时间飞行质谱表明酶解产物的分子量小于2000,苯酚硫酸法测定糖含量为2,Fo1in一酚试剂法测蛋白含量为93。大鲵酶解产物清除羟基自由基(·OH)和DPPH自由基的能力随浓度升高而增强。

关键词:大鲵肉;酸性蛋白酶;抗氧化活性

大鲵是世界上现存最大的也是最珍贵的两栖动物。它的叫声很像幼儿哭声,因此人们又叫它“娃娃鱼”,是国家二类保护水生野生动物,是农业产业化和特色农业重点开发品种。由于大鲵具有较高的营养和药用价值,被视为珍品。大鲵肉中蛋白含量丰富,氨基酸组成全面,符合人体需要量模式,且呈味氨基酸含量和比例都较高,味道鲜美。

本文以大鲵肉为原料,利用酸性蛋白酶进行酶解,对其酶解产物进行抗氧化活性试验,发现其具有较强的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1材料

大鲵肉,2010年10月由张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司提供。

Aspergillus sp.酸性蛋白酶由大连海洋大学·张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司生物技术联合实验室制备。其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1大鲵肉酶解液的制备取新鲜的大鲵肉,洗净后用组织捣碎机研磨成糜状物,加入一定量的水,搅拌均匀后加入酸性蛋白酶,改变酶解温度、pH、加酶量和酶解时问等闲素,测定酶解产物的肽得率。

1.2.2蛋白质含量和酶解液肽含量的测定蛋白含量采用Folin一酚法测定;采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后,采用Folin一酚法测定酶解液的肽含量。

1.2.3糖含量的测定采用三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后,用苯酚一硫酸法测定样品中糖含量。

1.2.4大鲵肉酶解产物分子量的测定大鲵肉酶解液冻于后的产物用5~1OL0.15三氟乙酸(TFA)溶解后离心,取离心后的上清液与等体积的基质混合点靶进行时问飞行质谱(MALDI—TOF)测定。质谱测定的条件:N激光源,波长337nm,正离子线性方式检测(飞行管长1.6m,加速电压为25kV)。基质:芥子酸(SA),用0.1TFA/5O的乙腈配成饱和溶液,再将该溶液与0.1TFA/50的乙腈以1:1的比例混合。

1.2.5清除羟基自由基(·OH)能力的测定
分别取酶解液2mL,加人1mL9mmol/L的Fe—SO,9mmol/I的水杨酸一乙醇2mL,混匀后加入质量分数为7.5的双氧水2mL启动反应,在37℃水浴保温30min,以蒸馏水作为空对照,于510nm下测吸光度,考虑到样品本身的吸光度以9mmol/I的FeSO41mL,9mmol/L的水杨酸乙醇2mI,不同浓度的酶解液2mI为本底吸收‘。清除率计算公式如下:.OH清除率/%一一(A^一A)/×100式中,A。为空白对照的吸光度值;A为加入样液的吸光度值;A如为不加H0。的样液的吸光度值。

1.2.6清除DPPH自由基能力的测定用无水乙醇配制2.0×10raol/L的DPPH溶液,于棕色瓶中低温避光保存备用。分别取2mL酶解液于试管中,加入2mL所配制的DPPH溶液,混合均匀,在25℃水浴中反应30min,移人lcm比色管中,于517nm处测定其吸光度值Ai,同时测定2mL样液加2mL无水乙醇25℃水浴中反应3Orain后的吸光度值Aj,以及2mLDPPH加2mL蒸馏水25℃水浴中反应30min后的吸光度值A。,酶解液对DPPH的清除率按下式计算:清除率/一Ao一(A;一A)/A。×100式中,为试剂空白的吸光值;A为样液的吸光值;Aj为样液本底的吸光值。

2 结果与讨论

2.1酶解大鲵肉制备低聚肽单因素条件的影响

2.1.1酶解温度对大鲵肉酶解的影响将酶解条件设定为:pH值2.0,加酶量为0.5(质量比),于4O、45、50、55、60℃下分别酶解4.5h,底物浓度为0.1g/mL,测肽得率如图1所示。由图1可知,当酶解温度在40~6O℃之间变化时,随着酶解温度继续上升,肽得率逐渐升高,当温度达到55℃,肽得率达到最大值后,再继续提高酶解温度,所得的肽得率出现下降的趋势。温度过高,可以使酶变性甚至失活。但当温度达到45℃后,肽得率变化不是很大,考虑到成本等问题,所以,确定大鲵肉酶解反应的最适温度为45℃。

2.1.2 酶解时间对大鲵肉酶解的影响将酶解
条件设定为:pH值2.0,加酶量为0.5(质量比),于45℃下分别酶解1.5、3、4、5、6h,底物浓度为0.1g/mL。测定肽得率如图2所示。由图2可知,当酶解时间在3~5h之间变化时,随着酶解时间的增大肽得率不断增加,但在5h后上升幅度趋于平缓,故确定 酶解 时间为5h最佳 。

2.1.3 pH值对大鲵肉酶解的影响将酶解条件设定为:pH分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,加酶量为0.5(质量比),于45℃下酶解5h,底物浓度为0.1g/mL。测定肽得率如图3所示。由图3可知,随着pH的不断升高,肽得率出现下降趋势,所以,大鲵肉酶解液反应的最适pH为2.0。

2.1.4 酶加量对大鲵肉酶解的影响将酶解条件设定为:pH值2.0,加酶量为0.29,6、0.39,6、0.4、0.5、0.6(质量比),于45℃下分别酶解5h,底物浓度为0.1g/mL。测定肽得率如图4所示。由图4可知,当加酶量不断增加时,肽得率不断上升,当酶加量大于0.3时,肽得率上升幅度平稳,综合成本和肽得率两方面考虑,确定酶加量为0.4(质量比)。

2.1.5 最佳酶解条件的确定影响酶解反应的几个主要因素为酸性蛋白酶的加酶量、酶解时间、pH和酶解温度。根据上述单因素试验分析,并考虑生产成本等因素,以所得肽得率为指标做酶加量,酶解时间,pH和温度4因素3水平的正交试验L9(34),正交试验的因素水平见表1,正交试验结果见表2。

由表2可知,各因素对酶解大鲵肉制备低聚糖肽影响的大小顺序为B>C>D>A,即酶解温度>酶解时问>加酶量>pH。各个因素的影响顷序为BC。D。A,由表2可以看出,BCDA。

肽得率最高,因为pH值的影响不是最明显的,所以最优水平为B。C。D2A,即pH为2.0,酶解温度为45℃,酶解是间为5.5h。加酶量为0.4(质量比)。

2.2 大鲵肉酶解产物分子量的测定

图5的飞行质谱表明酸性蛋白酶酶解大鲵肉获得的产物,确定为低聚肽,核质比在小于2000的区域。m/z主要有948.365、1020.105、1150.219、1262.864、1435.411、1830.835。

2.3大鲵肉酶解液抗氧化性的研究2.3.1清除羟基自由基(·OH)能力测定准确称取冻干后的酶解产物,将其配成2mg/mL的溶液,分别取0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、2.0mL上述溶液,按1.2.5的方法测定其清除羟基自由基能力,结果如图6。

随着酶解液浓度的增加,羟基自由基(·OH)的清除率达到86左右就趋于平缓增加状态,一直增加到89左右,清除率不再增大,故大鲵酶解液肽粉的浓度达到2mg/mL,清除羟基自由基(·OH)能力达到最大。

2.3.2清除DPPH自由基能力的测定准确称

取冻干后的酶解产物,将其配成2mg/mL,分别取0.6mL、0.8mL、1.01TIL、1.2mL、1.4mI上述溶液,加蒸馏水至2mL,按1.2.6的方法测定其清除DPPH自由基能力,结果如图7。

随着酶解产物浓度的增加,DPPH的活性清除率达到80%左右就趋于平缓状态,故大鲵酶解液肽粉的浓度达到1.2mg/mL,DPPH清除率达到最大。

3 结论

由试验结果可知,酸性蛋白酶水解大鲵肉的最适条件为pH为2.0,酶解温度45℃,酶解是问5.5h,加酶量0.4%(质量比)。酶解产物具有清除羟基自由基和DPPH自由基的能力,测定结果表明当大鲵肉酶解液低聚肽的浓度达到2mg/mL,清除羟基自由基(·OH)能力达到最大,当浓度达到1.2mg/mL时,DPPH清除率达到最大。