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大鲵肽在牙膏中的应用研究

摘要:采用酶法从人工饲养大鲵肉中提取得到大鲵肽,利用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)测定其分子量主要为1422,1521,1746,1828和1879,均小于2000,酶解产物大鲵肽为低聚肽。将提取到的大鲵肽应用到牙膏中,应用自由基清除活性评价方法研究了大鲵肽牙膏的抗氧化活性。结果表明,牙膏中添加质量分数为0.1%的大鲵肽可达到较好的抗氧化效果,其牙膏水溶液具有清除DPPH自由基、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基以及ABTS自由基的能力。

关键词:牙膏;大鲵肽;抗氧化

中国大鲵(Andriasdavidianus),俗称娃娃鱼,是目前地球上仅存三种隐鳃鲵科中体形最大、品质最优的一种,已列入国家二级保护动物名录,为我国特有的珍稀两栖动物。由于大鲵中富含多种有益于人类健康的活性成分,目前人工养殖业正在兴起。大鲵肉的酶解产物为大鲵肽,前期研究发现大鲵肽具有清除自由基活性、抑制ACE活性、提高小鼠免疫功能、抗疲劳、促进小肠吸收和促进上皮细胞增殖等作用。目前,未见将大鲵肽添加到牙膏中的相关研究与报道。外界环境中的空气污染、阳光辐射、呼吸作用、农药等都会让人体产生自由基。过多的自由基会导致人体和组织的损坏,从而引起疾病,所以研究抗氧化可以有效克服其带来的危害。本文从养殖大鲵的肉中提取大鲵肽,将其添加到牙膏中,应用自由基清除活性评价方法,以探究大鲵肽牙膏的抗氧化能力,使牙膏由普通洁齿型向功效性方向发展。

1 实验部分

1.1主要试剂与仪器大鲵肉,由张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司提供;Aspergillus sp.酸性蛋白酶,由大连海洋大学·张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司生物技术联合实验室制备;DPPH、ABTS,美国Sigma公司;水杨酸、双氧水、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、过硫酸钾(K2S2O8),天津市科密欧化学试剂有限公司。XS-02多功能组织捣碎机,东莞市隆鑫机电设备有限公司;BS-224S精密电子分析天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;UV-754紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;5800MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱仪,美国ABSciex公司。

1.2实验方法

1.2.1大鲵肽的提取取新鲜的大鲵肉,洗净后用组织捣碎机打碎成糜状物,加入一定量的水,搅拌均匀后用冰醋酸调节pH=2.0,加入占大鲵肉质量分数为0.4%的Aspergillus sp.酸性蛋白酶,45℃下酶解5.5h,得到的酶解液冷冻干燥,即得大鲵肽。

1.2.2大鲵肽分子量的测定使用MALDI-TOF/TOF测定大鲵肽的分子量。反射模式离子源加速电压为20kV,氮气激光器波长为337nm,质谱信号单次扫描累加1000次。首先将1μL大鲵肽样品和肽标准分别点至样品靶上,自然干燥后,再取0.6μL芥子酸(SA)基质溶液点至靶位上并自然干燥。通过MALDI-TOF/TOF正离子模式下选择反射方法对样品测试范围进行校准,然后测量样品分子量。标准物质校准范围为:1046.542±0.5,1533.858±0.5,2465.199±0.5和3494.651±0.5。

1.2.3大鲵肽牙膏配方及质量测定实验牙膏配方如表1所示,本配方经45℃烘箱考察3个月稳定。牙膏质量参照国家标准GB8372-2008进行测定。

1.2.4 DPPH自由基清除实验参照文献的方法,取不同质量浓度的牙膏样品溶液2mL,分别加入0.1mmol/L的DPPH溶液2mL于试管中,混合摇匀,于室温黑暗的环境中静置30min,在波长517nm处测定吸光度(A),以无水乙醇溶液作空白,DPPH自由基清除率的计算公式如下:DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%(1)式中,Ac为未加入样品时DPPH的吸光度;Aj为未加入DPPH时样品的吸光度;Ai为样品和DPPH混合反应后的吸光度。

1.2.5 羟基自由基(·OH)清除实验按照文献的方法,取不同质量浓度的牙膏样品溶液2mL,分别加入9mmol/L的FeSO41mL,9mmol/L的水杨酸-乙醇1mL,最后加入8.8mmol/L的双氧水1mL,37℃下反应30min,以蒸馏水为空白,在510nm处测定吸光度,考虑到样品本身的吸光度,取未加双氧水的溶液作为本底吸收。·OH清除率的计算公式如下:·OH清除率=[1-(Ax-Axo)/Ao]×100%(2)式中,Ao为空白对照的吸光度;Ax为加入样品溶液的吸光度;Axo为未加双氧水的样品溶液的吸光度。

1.2.6 超氧阴离子自由基清除实验参照文献报道的邻苯三酚自氧化法稍加改动进行计算。向试管中添加4.5mLpH=8.2的Tirs-HCl缓冲液和4.2mL的蒸馏水,25℃水浴中反应10min,接着向试管中加入0.3mL45mmol/L的邻苯三酚溶液,混合均匀,在波长325nm处每隔1s测量溶液的吸光度。1min后,以波长为纵坐标、时间为横坐标作图,计算斜率,记为K0;向试管中添加4.5mLpH=8.2的Tirs-HCl缓冲液、3.2mL蒸馏水和1mL不同质量浓度的牙膏样品溶液,同样的方法计算斜率,记为Kb。超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下:超氧阴离子自由基清除率=(1-Kb/K0)×100%(3)

1.2.7 ABTS自由基清除实验按照文献的方法,加入7.4mmol/L的ABTS储备液,与2.6mmol/L的K2S2O8于黑暗室温下反应12h,再用pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释,使其在波长734nm处的吸光度为0.70±0.02,在反应体系中,于试管中分别加入0.2mL不同质量浓度的牙膏样品和参比溶液(pH=7.4的PBS),再加入0.8mL的ABTS反应溶液,振荡摇匀,室温下静置6min,在波长734nm处测定吸光度。ABTS自由基清除率的计算公式如下:ABTS自由基清除率=(1-AS/A0)×100%(4)式中,AS为加入样品溶液的吸光度;A0为对照溶液的吸光度。

1.2.8 数据处理所有数据均以“均值±标准差”表示,实验结果采用Excel和SPSS统计软件分析。

2 结果与讨论

2.1 大鲵肽分子量的测定使用MALDI-TOF/TOF测定大鲵肉的酶解产物,质荷比(m/z)主要为1422,1521,1746,1828和1879,均小于2000。大鲵肉酶解获得的大鲵肽确定为低聚肽。

2.2 大鲵肽牙膏的技术指标表2为大鲵肽牙膏质量指标与国家标准的对照。从表2中可以看出,大鲵肽牙膏pH、过硬颗粒、膏体、稳定性、菌落数等指标已达到了牙膏行业国家标准GB8372-2008的要求。

2.3大鲵肽牙膏水溶液抗氧化性能

2.3.1清除DPPH自由基能力大鲵肽牙膏水溶液对DPPH自由基的清除能力如图1所示。由图1可知,在一定的浓度范围内,大鲵肽牙膏水溶液对DPPH自由基的清除率与质量浓度呈线性增长关系;当大鲵肽牙膏质量浓度为20g/L时,其清除率为40.50%,说明大鲵肽牙膏水溶液具有一定的清除DPPH自由基的能力。


图1大鲵肽牙膏水溶液清除DPPH自由基能力
Fig.1ScavengingeffectsonDPPHfreeradicalsoftheAndrias
davidianusformulatedtoothpasteaqueoussolution


2.3.2清除·OH能力大鲵肽牙膏水溶液对·OH的清除能力如图2所示(见下页)。由图2可知,大鲵肽牙膏水溶液具备清除·OH的能力,并且随着质量浓度的提高其清除活性随之提升;质量浓度为10,50和100g/L时,其清除率分别为33.49%,64.82%和99.20%,其清除·OH的IC50为18.55g/L,说明大鲵肽牙膏水溶液具有一定的清除·OH的能力。2.3.3清除超氧阴离子自由基能力大鲵肽牙膏水溶液对超氧阴离子自由基的清除能力如图3所示(见下页)。由图3可知,在一定的质量浓度范围内,大鲵肽牙膏水溶液具有清除超氧阴离子自由基的能力,并且清除率与质量浓度呈线性增长关系,质量浓度为100g/L时,清除率达到41.86%。2.3.4清除ABTS自由基能力大鲵肽牙膏水溶液清除ABTS自由基的能力如图4所示(见下页)。由图4可知,在一定质量浓度范围内,随着大鲵肽牙膏水溶液质量浓度的增加,ABTS自由基清除率也增加;质量浓度为50g/L时,清除率达到了38.33%。

2.3.2 清除·OH能力大鲵肽牙膏水溶液对·OH的清除能力如图2所示(见下页)。由图2可知,大鲵肽牙膏水溶液具备清除·OH的能力,并且随着质量浓度的提高其清除活性随之提升;质量浓度为10,50和100g/L时,其清除率分别为33.49%,64.82%和99.20%,其清除·OH的IC50为18.55g/L,说明大鲵肽牙膏水溶液具有一定的清除·OH的能力。

2.3.3清除超氧阴离子自由基能力大鲵肽牙膏水溶液对超氧阴离子自由基的清除能力如图3所示(见下页)。由图3可知,在一定的质量浓度范围内,大鲵肽牙膏水溶液具有清除超氧阴离子自由基的能力,并且清除率与质量浓度呈线性增长关系,质量浓度为100g/L时,清除率达到41.86%。

2.3.4清除ABTS自由基能力大鲵肽牙膏水溶液清除ABTS自由基的能力如图4所示(见下页)。由图4可知,在一定质量浓度范围内,随着大鲵肽牙膏水溶液质量浓度的增加,ABTS自由基清除率也增加;质量浓度为50g/L时,清除率达到了38.33%。

3 结论

研究大鲵肽发现,其分子量主要为1422,1521,1746,1828和1879,均小于2000,酶解产物大鲵肽为低聚肽,并且生产的大鲵肽牙膏质量符合国家标准。大鲵肽牙膏水溶液清除DPPH自由基、·OH、超氧阴离子自由基以及ABTS自由基的效果较好。大鲵肽牙膏在牙膏行业首创了牙齿抗衰老的理念,大鲵肽天然物质在牙膏中的应用有望取代合成抗氧化剂的使用,令牙膏更“绿色”,可避免安全性方面的隐患,具有广阔的应用前景。