摘 要: 近年来, 随着大鲵养殖业的发展, 对大鲵进行深加工成为大鲵产业发展的关键。大鲵体表黏液是一种有重要应用价值的生物资源。大鲵体表黏液主要含有蛋白质及多糖类物质。利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及膜分离、纳滤膜除盐等步骤, 从大鲵体表黏液中制备出了分子量小于 3500 Da的大鲵低聚糖肽。β-消旋反应、血凝集抑制试验结果表明大鲵低聚糖肽具有 O-连接糖肽键。大鲵低聚糖肽具有促进小鼠免疫功能的作用、体外抗氧化活性、抗疲劳作用、抗紫外线能力以及对 CCl4 导致小鼠肝损伤具有保护作用。大鲵低聚糖肽在食品、保健食品以及药品领域有着广泛的潜在应用。本文对大鲵低聚糖肽这一新的生物活性物质的制备、特性及生物活性研究进行全面的论述总结, 以期为正确鉴定、研究及利用大鲵低聚糖肽提供方法与数据。
关键词: 大鲵低聚糖肽; 黏液; 鉴定; 应用

基金项目: 湖南省战略性新兴产业科技攻关与重大科技成果转化项目(2013GK4100)
 

1 引 言

大鲵

(Andrias davidianus)是我国二级保护动物。自20 世纪 80 年代开始, 为了保护这一珍稀物种, 人们开始了大鲵繁育养殖实验, 先后解决了培育大鲵亲本的方法以及大鲵亲本雌雄发育同步的技术难题, 成功进行了野生大鲵驯养繁殖等方面的研究, 形成了一批大鲵养殖企业。随着大鲵养殖规模的扩大, 大鲵产量的迅速增加, 国家相关主管部门逐步放宽了子二代大鲵作为产品进入市场的禁令,获得经营大鲵产品资质的企业越来越多。大鲵养殖业已逐渐成为调整农业结构、促进农民增收的新兴养殖产业。但是目前大鲵的养殖产量并没有和养殖效益成正比, 这其中主要原因是大鲵深加工的科研成果不多, 没有形成高值化利用的技术与产品。
大鲵作为我国珍贵的国家二级保护动物, 除了具备的生物学和生态学的价值外, 大鲵体内独特的营养成分等化学物质组成也使其具有较高的经济和药用价值。研究表明, 大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液等含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸及微量元素等。大鲵体表黏液也是大鲵中具有重要开发利用价值的一种资源。自2008 年 7 月起, 张家界(中国)金驰大鲵生物科技有限公司就根据企业自身发展需要, 开始了与大连海洋大学合作开始进行了大鲵体表黏液的研究。经过近两年多的研究, 率先利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及酶膜反应技术, 从大鲵体表黏液中制备出分子量小于3500 Da 的大鲵低聚活性糖肽。2010 年 3 月申报了“大鲵低聚糖肽、制备方法及其在化妆品中的应用”的发明专利,于 2013 年 9 月获得了专利授权。随后, 大连海洋大学对大鲵低聚糖肽的制备工艺、结构、活性及其应用进行了深入研究, 获得了许多关于大鲵低聚活性糖肽的研究结果。这些研究结果为大鲵低聚活性糖肽在食品、保健食品、新资源食品、特殊医学用食品以及药品等领域的应用提供了重要的基础数据。令人感兴趣的是随后出现的其他一些研究者对大鲵低聚活性糖肽进行了研究, 如陈丽萍等研究了大鲵低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性。王茁研究了不同育龄大鲵皮肤黏液中低聚糖肽抗氧化活性。还有一些大鲵产业相关的公司准备进行大鲵低聚糖肽相关产品的研发。

2 大鲵低聚糖肽的研究

2.1 大鲵低聚糖肽的制备
大鲵体表黏液是制备大鲵低聚糖肽的原料。大鲵皮肤表面具有丰富的黏液腺和颗粒腺, 颗粒腺分泌大量乳白色液体, 黏液腺分泌的水样透明液, 并且皮肤腺收缩时可排出腺腔中的黏蛋白类及多糖类物质, 能保持皮肤湿润。在大鲵的生长过程中, 它会不断分泌大鲵黏液, 一条成年大鲵每年分泌的大鲵黏液可达 500 g。刘绍等和 Li 等对大鲵体表黏液的氨基酸组成进行了测定分析, 发现其氨基酸组成全面, 可以作为优质食物蛋白的来源。陈德经等从大鲵体表黏液中提取了多糖, 最高提取率为 4.23%, 并发现不同的提取方法获得的多糖的单糖组成存在差异。金桥等整理了大鲵黏液氨基酸组成的摩尔比, 发现摩尔百分比的最高的氨基酸是苏氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺。Guo 等接着从大鲵黏液中分离出磷酸脂酶 A2, 同时还发现大鲵黏液具有损伤活性和蛋白酶活性,经 SDS-PAGE 对大鲵黏液蛋白进行检测, 发现其分子量分布较宽。王利锋等利用 5%乙酸浸提、SephadexG-50 及 Sephadex G-25 凝胶过滤层析, 从电刺激法获得的大鲵黏液中获得了一种分子量为 4300 Da 的具有抗菌活性的肽, 该肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌和白色念珠菌均有较强的抑菌作用, 对这些菌的最小抑菌浓度分别为 12、16、16、22、16 及 18 μg/mL。因此, 大鲵黏液是一种有价值的糖蛋白的来源。酶解技术是利用蛋白质、多糖类资源的一种有效的技术。酶解技术的优点是可以将水不溶的蛋白质、多糖类化合物酶解成具有可溶性小分子的肽、寡糖类化合物, 使其具有更好的生物活性。大鲵分泌出的体表黏液, 在空气及水环境中, 很快凝固形成透明片状物。实验表明, 大鲵黏液在乙醇浓度较低时, 溶解度较小, 在乙醇浓度达到 70%时, 浓度略有上升, 在 EDTA、EDTA/甲醇中, 大鲵黏液溶解度略有增加。因此, 选择合适的酶进行酶解成为利用大鲵黏液的关键。经过反复实验, 利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及膜分离、超滤膜除盐等步骤, 从大鲵体表黏液中制备出了分子量小于 3500 Da的大鲵低聚活性糖肽。

2.2 大鲵低聚糖肽结构
大鲵低聚糖肽的红外光谱表明, 其具有 3275.2、1653.3 和 1454.9 cm-1的酰胺官能团、3063.8 cm-1的咪唑官能团以及 2962.3、1402.3 cm-1的羟基特征峰。β-消旋反应是鉴定糖肽的一种常用的方法, 与 O-糖肽键连接的丝氨酸生成 α-氨基丙烯酸, 苏氨酸生成 α-氨基丁烯酸, 这种不饱和氨基酸的形成, 使糖肽在 240 nm 波长处紫外吸收增强。β-消旋反应前后大鲵低聚糖肽在 240 nm 处的紫外吸收显著增强, 说明大鲵低聚糖肽中存在 O-连接糖肽键。海绵凝集素(craniella australiensis lectin, CAL)可以专一识别-Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser /Thr 结构。利用 CAL 的血凝活性测试证实了大鲵低聚糖肽中存在 O-连接糖肽键。Kong 等利用高效液相色谱(high performance liquidchromatography, HPLC)(NH2, 150 mm×4.6 mm ID)从大鲵糖肽中分离出 15 个含有糖链的化合物, 质谱检测其分子量小于 3500 Da。

2.3 大鲵低聚糖肽的生物活性
对于大鲵低聚糖肽的生物活性也进行了大量的研究。曲敏等研究了大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响, 饲喂大鲵低聚糖肽的小鼠血清中的 IgG 含量、吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数以及 T 淋巴细胞活性均显著提高。曲敏研究了大鲵低聚糖肽体外抗氧化活性, 大鲵低聚活性糖肽具有较好的清除自由基的活性。大鲵低聚糖肽对血管紧张素转换酶(angiotesin-converting enzyme, ACE)具有较好的抑制活性, 因此可以作为潜在的抗高血压药物进行深入研究。大鲵低聚糖肽抗疲劳作用研究表明, 大鲵低聚糖肽具有显著抗疲劳作用。大鲵低聚糖肽具有较强的抗紫外线能力, 因此被用来开发成化妆品。大鲵低聚糖肽还对CCl4 导致的小鼠肝损伤具有保护作用。研究表明, 大鲵低聚糖肽与 Caco-2 细胞、HaCaT 细胞相互作用后, 大鲵低聚糖肽可以进入到细胞内部。HaCaT 细胞模型具有人正常的皮肤上皮结构, 一般用来模拟人的皮肤细胞, 广泛应用于研究化妆品对于皮肤受损的修复以及紫外线保护作用等方面的研究。

2.4 大鲵低聚糖肽鉴定
糖肽(glycopeptide)即由短糖链和短肽连接而成所得到的化合物。近年来, 在动物、植物及微生物中都有大量的糖肽被发现。比如从植物中获得的有魔芋甘露聚糖肽、板蓝根糖肽以及云芝糖肽等。从动物中获取的糖肽有文蛤糖肽、马鹿茸降血糖肽、大鲵低聚糖肽以及海蜇糖肽等。微生物和病毒表面往往具有糖肽结构。进行糖肽的鉴定, 首先需要进行糖肽的富集。糖肽富集的方法有化学方法、超支化聚合物富集方法、二氧化钛结合超滤膜富集方法、氧化铝富集方法等。在确定其是否来自大鲵, 最准确的办法就是使用PCR 技术。除此之外, HPLC、红外光谱、β-消旋反应、质谱等等也是可以选择的手段。如江静等利用亲水相互作用色谱结合串联质谱对完整的糖肽进行了分离纯化以及鉴定。β-消旋反应可以鉴定糖肽键连接类型。β-消旋反应前后, 具有 N-连接糖肽键的糖肽在 240 nm 波长处紫外吸收不发生变化, 而 O-连接糖肽键在 240 nm 处的紫外吸收显著增强。对大鲵低聚糖肽进行纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱分析, 串联质谱图经 Micromass 专用软件处理后, 用 Spectrum List 通过 Mascot 查询 NCBI、SWISSPROT 等数据库, 经 MasSeq 软件分析, 得到 3 个序列为: KAPILSDSSCKSC、KLQGTVSWGSGCQAKNC 和VVHSLVQVTANKVMVRM。这 3 个肽序列与肽数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中肽无同源性。

化学方法测定大鲵低聚糖肽中总蛋白含量较高为80.01%, 总糖含量为 15.15%。总糖中盐酸氨基葡萄糖最高, 半乳糖醛酸其次, 之后依次为葡萄糖醛酸和唾液酸,分别占大鲵低聚糖肽 3.39%、2.45%、0.65%、0.60%, 占总糖含量的 22.38%、16.17%、4.29%和 3.69%, 不含硫酸糖。从不同产地、不同季节、不同生长阶段获得的大鲵低聚糖肽其糖的组成不同, 但是组成多糖的单糖单元比较多。

血凝活性测试方法是比较简单快捷的方法。这种方法需要利用海绵凝集素 CAL 的糖识别特性。CAL 是一种专一识别 O-连接糖肽键的凝集素。对大鲵低聚糖肽的O-连接糖肽键特异性识别, 大鲵低聚糖肽的分子结构与CAL 的糖结合位点正好相符。

3 结论与展望
大鲵自古以来就是传统的药用动物, 在《本草纲目》、《草本纲目拾遗》等经典医著中均有描述。中医认为大鲵性甘平, 有补气、养血、益智、滋补、强壮等功效。主治神经衰弱, 病后体虚, 贫血, 痢疾等。1978 年出版的《全国中草药汇编》将大鲵列为药品, 主治神经衰弱、病后体虚、贫血、痢疾等。大鲵的皮肤、肌肉、脏器、骨骼等均可入药, 可见其在中药学中的地位。在传统医学中, 大鲵一般去除内脏后全体入药, 每次用量为 15~30g。民间有以大鲵皮肤粉拌桐油治疗烫伤、以其胆汁用以解热明目、以胃治疗小孩消化不良、以皮肤黏液预防麻风病的方法, 疗效明确。大鲵作为中药, 其确切的疗效已经为人们所公认。但中药的疗效往往有很多未解之谜,需要运用化学、生物等手段进行分析, 以便解开中药药理作用的秘密。大鲵作为中药, 同样存在着许多的未解之谜。

大鲵低聚糖肽作为一种新的具有生物活性的物质,一经出现就引起了人们的极大关注。通过对大鲵低聚糖肽结构及生物活性的深入研究, 有助于促进大鲵药理作用的深入研究, 也有助于大鲵的高值化在食品、保健食品以及药品领域的应用。